一种地龙抗菌肽的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物制剂领域，尤其涉及一种地龙抗菌肽的制备方法。
【背景技术】
[0002]虫丘虫引又称地龙，虫丘虫引体内存在着抗菌肽（antibacterialpeptides)，在多种生物免疫系统中，抗菌肽是由基因编码、核糖体合成的具有抗菌活性的一类小分子多肽。抗菌肽具有广谱杀菌活性，包括杀伤革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、双歧杆菌、螺旋体、原虫等，并能中和某些胞膜病毒，尤其重要的是，由于其杀菌机理完全不同于传统的抗生素，微生物极少可能对动物抗菌肽产生耐药性，由此证明地龙抗菌肽具有很高的药用开发应用价值。但是到目前为止，关于地龙抗菌肽制备方面的相关研宄比较少。
【发明内容】
[0003]本发明针对上述技术问题，提供了一种操作简单的地龙抗菌肽的制备方法。
[0004]本发明所采用的技术方案为：
一种地龙抗菌肽的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
(O取新鲜的蚯蚓加水浸泡，清洗干净，沥干水分；
(2)在所述步骤（I)所得蚯蚓中加入1-5倍体积的O.01-0. 05 mol/L、pH值为5. 0-7. O的磷酸盐缓冲溶液，捣碎；
(3)所述步骤（2)所得捣碎物加入反应釜中，在1_7°C下搅拌浸提，浸提完毕后，离心，取其上清液；
(4)在所述步骤（3)所得上清液中，在1-7°C下，加入硫酸铵固体，使其硫酸铵的饱和度达到 30%-85% ；
(5)将所述步骤（4)所得混合物静置后在1_7°C下离心，弃上清，收集沉淀，透析，浓缩，得到地龙抗菌肽粗品。
[0005]所述蚯蚓选用大平2号赤子爱胜蚓。
[0006]所述步骤（I)中，浸泡的较优时间为12_36h。
[0007]所述步骤（I)中，浸泡的较优时间为24h。
[0008]所述步骤（2)中，磷酸盐缓冲溶液的较优用量为蚯蚓体积的2倍，较优浓度为O. 02mol/L、较优pH值为6. O。
[0009]所述步骤（3)中，浸提的较优温度为4°C，较优时间为12_36h。
[0010]所述步骤（3 )中，浸提的较优时间为24h。
[0011 ] 所述步骤（4 )中，硫酸铵固体加入的较优温度为40C，硫酸铵固体的较优细度多80目，较优的饱和度为75%。
[0012]所述步骤（5)中，静置的较优时间为2_6h，较优的离心温度为4°C，透析袋的较优截留分子量为12000?14000。
[0013]所述步骤（5)中，静置的较优时间为4h。
[0014]本发明的有益效果为：
1、本发明中的操作非常简单，易于推广；
2、提取原料选用大平2号赤子爱胜蚓，抗菌肽含量高；
3、本发明得到的地龙抗菌肽粗品中抗菌肽的含量达到16.lg/100g，含量非常高。
【具体实施方式】
[0015]实施例I
一种地龙抗菌肽的制备方法，按照如下步骤进行：
(1)取新鲜的大平2号赤子爱胜蚓，在水中浸泡12h，使其吐出肠道中的泥土等异物，清洗干净，沥干水分；
(2)在步骤（I)所得蚯蚓中加入5倍体积的O.01mol/L、pH值为5. O的磷酸盐缓冲溶液，用组织捣碎机捣碎；
(3)步骤（2)所得捣碎物加入反应釜中，在7°C下恒温搅拌浸提36h，浸提完毕后，离心15min，取其上清液；
(4)在步骤（3)所得上清液中，在5°C下，缓慢加入研磨好的细度达到80目以上硫酸铵固体，边加边搅拌，使其硫酸铵的饱和度达到75% ；
(5)将步骤（4)所得混合物静置6h后在1°C下离心30min，弃上清，收集沉淀，用截留分子量为12000?14000的透析袋透析，透析好的粗蛋白液冷冻干燥浓缩，得到地龙抗菌肽粗品O
[0016]地龙抗菌肽粗品通过反向高效液相色谱法进行检测，提取粗品中抗菌肽的含量为15.8g/100go
[0017]实施例2
一种地龙抗菌肽的制备方法，按照如下步骤进行：
(1)取新鲜的大平2号赤子爱胜蚓，在水中浸泡24h，使其吐出肠道中的泥土等异物，清洗干净，沥干水分；
(2)在步骤（I)所得蚯蚓中加入2倍体积的O.02 mol/L、pH值为6. O的磷酸盐缓冲溶液，用组织捣碎机捣碎；
(3)步骤（2)所得捣碎物加入反应釜中，在4°C下恒温搅拌浸提24h，浸提完毕后，离心15min，取其上清液；
(4)在步骤（3)所得上清液中，在4°C下，缓慢加入研磨好的细度达到80目以上硫酸铵固体，边加边搅拌，使其硫酸铵的饱和度达到75% ；
(5)将步骤（4)所得混合物静置4h后在4°C下离心30min，弃上清，收集沉淀，用截留分子量为12000?14000的透析袋透析，透析好的粗蛋白液冷冻干燥浓缩，得到地龙抗菌肽粗品O
[0018]地龙抗菌肽粗品通过反向高效液相色谱法进行检测，提取粗品中抗菌肽的含量为
16.lg/100go
[0019]实施例3
一种地龙抗菌肽的制备方法，按照如下步骤进行：
(I)取新鲜的大平2号赤子爱胜蚓，在水中浸泡28h，使其吐出肠道中的泥土等异物，清洗干净，沥干水分；
(2)在步骤(I)所得蚯蚓中加入I倍体积的0.02 mol/L、pH值为7.0的磷酸盐缓冲溶液，用组织捣碎机捣碎；
(3)步骤(2)所得捣碎物加入反应釜中，在5°C下恒温搅拌浸提24h，浸提完毕后，离心15min，取其上清液；
(4)在步骤(3)所得上清液中，在1°C下，缓慢加入研磨好的细度达到80目以上硫酸铵固体，边加边搅拌，使其硫酸铵的饱和度达到65% ；
(5)将步骤(4)所得混合物静置2h后在5°C下离心30min，弃上清，收集沉淀，用截留分子量为12000?14000的透析袋透析，透析好的粗蛋白液冷冻干燥浓缩，得到地龙抗菌肽粗品O
[0020]地龙抗菌肽粗品通过反向高效液相色谱法进行检测，提取粗品中抗菌肽的含量为
16.0g/100go
[0021]实施例4
一种地龙抗菌肽的制备方法，按照如下步骤进行:
(1)取新鲜的大平2号赤子爱胜蚓，在水中浸泡36h，使其吐出肠道中的泥土等异物，清洗干净，沥干水分；
(2)在步骤(I)所得蚯蚓中加入3倍体积的0.05 mol/L、pH值为6.0的磷酸盐缓冲溶液，用组织捣碎机捣碎；
(3)步骤(2)所得捣碎物加入反应釜中，在2°C下恒温搅拌浸提12h，浸提完毕后，离心15min，取其上清液；
(4)在步骤(3)所得上清液中，在7°C下，缓慢加入研磨好的细度达到80目以上硫酸铵固体，边加边搅拌，使其硫酸铵的饱和度达到75% ；
(5)将步骤(4)所得混合物静置4h后在6°C下离心30min，弃上清，收集沉淀，用截留分子量为12000?14000的透析袋透析，透析好的粗蛋白液冷冻干燥浓缩，得到地龙抗菌肽粗品O
[0022]地龙抗菌肽粗品通过反向高效液相色谱法进行检测，提取粗品中抗菌肽的含量为15.9g/100go
[0023]以上对本发明的4个实施例进行了详细说明，但内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
【主权项】
1.一种地龙抗菌肽的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行: (1)取新鲜的蚯蚓加水浸泡，清洗干净，沥干水分； (2)在所述步骤(I)所得蚯蚓中加入1-5倍体积的0.01-0.05 mol/L、pH值为5.0-7.0的磷酸盐缓冲溶液，捣碎； (3)所述步骤(2)所得捣碎物加入反应釜中，在1_7°C下搅拌浸提，浸提完毕后，离心，取其上清液； (4)在所述步骤(3)所得上清液中，在1-7°C下，加入硫酸铵固体，使其硫酸铵的饱和度达到 30%-85% ； (5)将所述步骤(4)所得混合物静置后在1_7°C下离心，弃上清，收集沉淀，透析，浓缩，得到地龙抗菌肽粗品。
2.根据权利要求1所述的一种地龙抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述蚯蚓选用大平2号赤子爱胜蚓。
3.根据权利要求1所述的一种地龙抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述步骤(I)中，浸泡的较优时间为12-36h。
4.根据权利要求3所述的一种地龙抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述步骤(I)中，浸泡的较优时间为24h。
5.根据权利要求1所述的一种地龙抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，磷酸盐缓冲溶液的较优用量为蚯蚓体积的2倍，较优浓度为0.02 mol/L、较优pH值为6.0。
6.根据权利要求1所述的一种地龙抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，浸提的较优温度为4°C，较优时间为12-36h。
7.根据权利要求6所述的一种地龙抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，浸提的较优时间为24h。
8.根据权利要求1所述的一种地龙抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，硫酸铵固体加入的较优温度为4°C，硫酸铵固体的较优细度多80目，较优的饱和度为75%。
9.根据权利要求1所述的一种地龙抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中，静置的较优时间为2-6h，较优的离心温度为4°C，透析袋的较优截留分子量为12000?14000ο
10.根据权利要求9所述的一种地龙抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中，静置的较优时间为4h。
【专利摘要】本发明属于生物制剂领域，尤其涉及一种地龙抗菌肽的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行：（1）取新鲜的蚯蚓加水浸泡，清洗干净，沥干水分；（2）加入1-5倍体积的0.01-0.05mol/L、pH值为5.0-7.0的磷酸盐缓冲溶液，捣碎；（3）步骤（2）所得捣碎物加入反应釜中，在1-7℃下搅拌浸提，浸提完毕后，离心，取其上清液；（4）步骤（3）所得上清液中，在1-7℃下，加入硫酸铵固体，使其硫酸铵的饱和度达到30%-85%；（5）步骤（4）所得混合物静置后在1-7℃下离心，弃上清，收集沉淀，透析，浓缩，得到地龙抗菌肽粗品。本发明中的操作非常简单，易于推广。
【IPC分类】C07K1-02
【公开号】CN104761613
【申请号】CN201510206865
【发明人】贾立明, 陈小明, 贾京华, 杨在得, 王凤艳
【申请人】天津民生生物工程有限公司
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2015年4月28日