从大枣中提取环磷酸腺苷的方法
【专利说明】
[0001]
技术领域
本发明涉及一种从大枣中提取环磷酸腺苷的方法。
【背景技术】
[0002]环磷酸腺苷(cAMP)是当今分子生物学研究的重要内容之一，具有第二信使作用，控制并调节细胞内新陈代谢。基础医学研究证明至少40多种疾病(包括癌症、高血压、冠心、心肌梗塞和心源性休克等)与cAMP的代谢有关，临床医学研究证明cAMP对这些疾病有显著疗效。据报道，大枣中环磷酸腺苷的含量是已知植物中最高的，成熟枣肉中的cAMP含量是一般动植物的数万倍，因此具有非常重要的开发利用价值。
[0003]现有的从枣中提取纯化环磷酸腺苷的技术基本上都是采用了溶剂浸提和柱层析技术。李明润等在中国专利200410018617.2 “从枣中提取环磷酸腺苷(cAMP)的工艺”中通过浸泡，匀浆，离心，浓缩和三次阴离子交换柱层析和一次氧化铝柱层析方法，得到环磷酸腺苷冻干粉，含量为750 nmol/g0中国专利200910066071.0 “一种提取枣中环磷酸腺苷的方法”中公开了利用微波高能处理后超声振动提取法，得到环磷酸腺苷含量430 nmol/g左右。综合看来，上述方法比化学合成法是具有成本低和无毒副作用的优点，但仍然存在提取周期长、效率较低、工艺复杂的不足。因此，从提取效率和质量及工业化生产等方面来看，现有的工艺都急需大力改进提闻。
【发明内容】
[0004]本发明目的在于提供一种工艺路线简单、成本低廉的从大枣中提取环磷酸腺苷的方法，得到高含量的环磷酸腺苷，克服传统提取工艺提取周期长、提取率较低、工艺复杂的不足，为进一步开发环磷酸腺苷生物活性提供原材料生产的技术保障。
[0005]本发明的技术方案:
采用大枣为原料，利用水提醇沉法得到大枣提取液，然后加入活性白土离心，再经大孔树脂分离得到的粗提物，最后采用聚酰胺柱纯化，得到含量80-91%的环磷酸腺苷。
[0006]一种从大枣中提取环磷酸腺苷的方法，其特征在于该方法步骤为:
A提取:采用大枣为原料，将其粉碎后，经水提醇沉得到大枣提取液；
B离心:将上述大枣提取液浓缩后加入活性白土高速离心，过滤去除沉淀后，将上清液浓缩；
C分离:将上述B步骤所得浓缩液通过大孔树脂进行分离，分别采用蒸馏水及乙醇洗脱，浓缩回收乙醇洗脱液；
D富集:将上述C步骤所得乙醇浓缩液，通过阴离子交换树脂分离富集，分别采用蒸馏水及酸性溶液洗脱，浓缩酸性洗脱液得环磷酸腺苷粗提物；
E纯化:将上述D步骤所得环磷酸腺苷粗提物采用聚酰胺柱纯化，分别采用蒸馏水及乙醇溶液洗脱，浓缩回收乙醇洗脱液，得到环磷酸腺苷。
[0007]本发明中环磷酸腺苷的测定采用高效液相色谱法。
[0008]对于本发明所述的方法，继续进行进一步的描述:
本发明步骤A提取:
称取大枣，粉碎后水煮广3次，合并水煮液，将水煮液浓缩后加入体积比5?10倍量乙醇进行沉淀，滤除沉淀后，将上清液浓缩至相对密度为1.02?1.12，得大枣提取液。
[0009]本发明步骤B离心:
加入枣原料质量3°/Γ?Ο%的活性白土，离心转速5000-10000 r/min,离心时间5_10分钟。
[0010]本发明步骤C分离:
用D-101或AB-8大孔吸附树脂进行分离，先用体积比5?10倍量的蒸馏水洗脱，再用体积比5?10倍量的含量为109Γ90%乙醇进行洗脱。
[0011]本发明步骤D富集:
通过D-301或D-315离子交换大孔树脂，先用体积比5?10倍量的蒸馏水洗脱，再用体积比5?1倍量的3%-10%的甲酸或3%-10%乙酸溶液洗脱。
[0012]本发明步骤E纯化:
用30-60目或60-100目或100-120目聚酰胺柱纯化，先用体积比5?10倍量的蒸馏水洗脱剂进行洗脱，再用体积比5?10倍量的109Γ90%乙醇洗脱剂进行洗脱。
[0013]本发明提供的大枣中环磷酸腺苷的提取方法与现有方法相比具有如下优点:
本发明提供的方法可以得到纯度80-91%的环磷酸腺苷。提取过程中通过加活性白土离心有效去除枣红素；采用的大孔树脂分离去除枣黄酮；通过阴离子交换树脂对环磷酸腺苷的特异性吸附，富集环磷酸腺苷；最后采用聚酰胺柱去除大枣中多酚类物质，纯化环磷酸腺苷。
[0014]该方法生产成本低、纯化效率高，易于实现工业化规模生产。
[0015]
【具体实施方式】
本发明将通过具体实施例进行详细的描述。
[0016]实施例1
准确称取100.0 g粉碎的大枣加入到2000 mL烧瓶中，用1000 mL蒸馏水提取三次，将所得的提取液合并，浓缩后加入300 mL的工业乙醇，产生沉淀，将沉淀滤除，浓缩上清液。在浓缩的上清液中加入5 g的活性白土离心，离心转速5000 r/min，离心时间5分钟，沉淀滤除后，将上清液浓缩至浸膏状。将浸膏状提取液通过100 g AB-8大孔吸附树脂分离，先用250 mL蒸馏水洗脱，然后用250 mL 30%乙醇洗脱，最后采用250 mL 90%乙醇洗脱。将上述30%乙醇洗脱液浓缩后通过D-301阴离子大孔树脂富集，分别用150 mL水及150 mL 3%的甲酸溶液洗脱。将3%的甲酸洗脱液浓缩后，通过30-60目聚酰胺柱，分别用100 mL水、100mL 30%乙醇、100 mL 90%乙醇洗脱。最后将上述30%乙醇洗脱液浓缩干燥。干燥产物采用液相色谱进行定量分析，此方法得到的环磷酸腺苷含量为85%。
[0017]实施例2
准确称取100.0 g粉碎的大枣加入到2000 mL烧瓶中，用1000 mL蒸馏水提取三次，将所得的提取液合并，浓缩后加入300 mL的工业乙醇，产生沉淀，将沉淀滤除，浓缩上清液。在浓缩的上清液中加入8 g的活性白土离心，离心转速8000 r/min，离心时间8分钟，沉淀滤除后，将上清液浓缩至浸膏状。将浸膏状提取液通过100 g AB-8大孔吸附树脂分离，先用300 mL蒸馏水洗脱，然后用300 mL 30%乙醇洗脱，最后采用300 mL 90%乙醇洗脱。将上述30%乙醇洗脱液浓缩后通过D-301阴离子大孔树脂富集，分别用200 mL水及200 mL 5%的甲酸溶液洗脱。将5%的甲酸洗脱液浓缩后，通过60-100目聚酰胺柱，分别用100 mL水、100 mL 30%乙醇、100 mL 90%乙醇洗脱。最后将上述30%乙醇洗脱液浓缩干燥。干燥产物采用液相色谱进行定量分析，此方法得到的环磷酸腺苷含量为88%。
[0018]实施例3
准确称取100.0 g粉碎的大枣加入到2000 mL烧瓶中，用1000 mL蒸馏水提取三次，将所得的提取液合并，浓缩后加入300 mL的工业乙醇，产生沉淀，将沉淀滤除，浓缩上清液。在浓缩的上清液中加入10 g的活性白土离心，离心转速10000 r/min，离心时间10分钟，沉淀滤除后，将上清液浓缩至浸膏状。将浸膏状提取液通过100 g AB-8大孔吸附树脂分离，先用500 mL蒸馏水洗脱，然后用500 mL 40%乙醇洗脱，最后采用500 mL 90%乙醇洗脱。将上述40%乙醇洗脱液浓缩后通过D-315阴离子大孔树脂富集，分别用300 mL水及300 mL8%的甲酸溶液洗脱。将8%的甲酸洗脱液浓缩后，通过100-120目聚酰胺柱，分别用100 mL水、100 mL 30%乙醇、100 mL 90%乙醇洗脱。最后将上述30%乙醇洗脱液浓缩干燥。干燥产物采用液相色谱进行定量分析，此方法得到的环磷酸腺苷含量为86%。
[0019]实施例4
准确称取100.0 g粉碎的大枣加入到2000 mL烧瓶中，用1000 mL蒸馏水提取三次，将所得的提取液合并，浓缩后加入300 mL的工业乙醇，产生沉淀，将沉淀滤除，浓缩上清液。在浓缩的上清液中加入5 g的活性白土离心，离心转速6000 r/min，离心时间8分钟，沉淀滤除后，将上清液浓缩至浸膏状。将浸膏状提取液通过100 g AB-8大孔吸附树脂分离，先用500 mL蒸馏水洗脱，然后用500 mL 50%乙醇洗脱，最后采用500 mL 90%乙醇洗脱。将上述50%乙醇洗脱液浓缩后通过D-315阴离子大孔树脂富集，分别用300 mL水及300 mL 3%的乙酸溶液洗脱。将3%的乙酸洗脱液浓缩后，通过100-120目聚酰胺柱，分别用100 mL水、100 mL 50%乙醇、100 mL 90%乙醇洗脱。最后将上述50%乙醇洗脱液浓缩干燥。干燥产物采用液相色谱进行定量分析，此方法得到的环磷酸腺苷含量为83%。
[0020]实施例5
准