80匪下进行洗脱平 衡好的反相C18硅胶柱，并用浓度为70%乙醇洗脱，得到粗多肽部位：
[0075] d、将步骤c得到的粗多肽部位利用旋转蒸发仪浓缩至无乙醇溶液残留后，采用截 留分子量为lKDa的再生纤维素平板膜，浓缩过程中压力0. 15MPa，温度25°C，流速35m/s， 浓缩倍数为5-10倍，得到鹰嘴豆多肽浓缩物，依次经过离心，冷冻干燥，过筛，紫外灭菌，包 装，即可得到鹰嘴豆多肽粉。
[0076] 实施例7
[0077] 鹰嘴豆豆瓣多肽粉的制备：
[0078] a、取鹰嘴豆发芽除牙之后的豆瓣用水冲洗3次至完全干净，分别用纱布过滤，合 并清洗后的鹰嘴豆豆瓣，低温干燥，控制温度在40°C，将干燥后的鹰嘴豆豆瓣，经粉碎机粉 碎，粉碎粒度为200目，按料液重量比为1 : 5加入石油醚，在室温下搅拌2小时，反复提取 4次至未有油脂提取出来为止，抽滤，合并沉淀，自然干燥至未有石油醚溶剂残留为止，得到 脱脂的鹰嘴豆粉；
[0079]b、将步骤a中充分脱脂的鹰嘴豆粉中加入浓度为50%食用乙醇，料液比为1 : 5， 在室温下搅拌提取2. 5小时，每次提取4次，减压抽滤，合并提取液，分离杂物，得到多肽粗 提取溶液备用；
[0080] C、将步骤b中得到的多肽粗提取溶液，利用蒸馏水稀释至乙醇浓度为18%，将稀 释的提取溶液，上已用18 %的乙醇，流速为3毫升/MIN，在UV-280匪下进行洗脱平衡好的 反相C18硅胶柱，并用浓度为70%乙醇洗脱，得到粗多肽部位：
[0081] d、将步骤c得到的粗多肽部位利用旋转蒸发仪浓缩至无乙醇溶液残留后，采用截 留分子量为lKDa的再生纤维素平板膜，浓缩过程中压力0. 15MPa，温度25°C，流速35m/s，浓 缩倍数为5-10倍，得到鹰嘴豆多肽浓缩物，依次经过离心，再喷雾干燥，过筛，紫外灭菌，包 装，即可得到鹰嘴豆多肽粉。
[0082] 实施例8
[0083] 鹰嘴豆豆渣多肽粉的制备：
[0084]a、取鹰嘴豆发芽除牙之后的豆瓣或干燥的有机溶剂提取小分子化合物后的鹰嘴 豆渣，经粉碎机粉碎，粉碎粒度为200目，按料液比为1 :5加入石油醚，在室温下搅拌1. 5小 时，反复提取4次至未有油脂提取出来为止，抽滤，合并沉淀，自然干燥至未有石油醚溶剂 残留为止，得到脱脂的鹰嘴豆粉；
[0085] b、将步骤a中充分脱脂的鹰嘴豆粉中加入50%乙醇，料液比为1 : 5,在室温下 搅拌提取2小时，每次提取4次，减压抽滤，合并提取液，分离杂物，得到多肽粗提取溶液备 用；
[0086] c、将步骤b中得到的多肽粗提取溶液，利用蒸馏水稀释至乙醇浓度为10%%，稀 释的提取溶液，上已用20 %的乙醇，流速为3毫升/MIN，在UV-280匪下进行洗脱平衡好的 反相C18硅胶柱，并用浓度为60%乙醇洗脱，得到粗多肽部位：
[0087] d、将步骤c得到的粗多肽部位利用旋转蒸发仪浓缩至无乙醇溶液残留后，采用截 留分子量为lOKDa的再生纤维素平板膜，浓缩过程中压力0. 15MPa，温度25°C，流速35m/s， 浓缩倍数为5-10倍，得到鹰嘴豆多肽浓缩物，依次经过离心，再喷雾干燥，过筛，紫外灭菌， 包装，即可得到鹰嘴豆多肽粉。
[0088] 实施例9
[0089] 将实施例1-8任意一种鹰嘴豆多肽粉，利用SDS-PAGE电泳、LC/MS技术 测量多肽分子质量，其结果表明：从SDS-PAGE电泳分析结果证实，该部位的多肽主 要分布于分量4. lKDA-20Kda之间的区域；LC/MS技术进一步证实该多肽部位是由 分量：4002. 5, 4151. 3, 4037. 43Da、4191. 8Da, 4276. 8Da, 4249. 63Da，4346. 2Da, 442 6.8Da，4459.3Da，4531.55.8Da、4614. 15D4a、5100.29Da、5168.98Da、5383. 8. 2Da、 5485. 2Da，5876. 8Da，6267. 6Da，6403. IDa，7023. 8Da、7923. 5. 57Da，7934. 21Da 和 7604. 3Da 等20的多种多肽密集共存的部位。
[0090] 实施例10
[0091] 将实施例1-8任意一种鹰嘴豆多肽粉按常规方法进行活性筛选：穴孔抑菌筛选 法，穴孔抑菌操作为如下：
[0092] 1.融化琼脂培养基，待其温度降至46±0. 5°C，加入已培养好的菌液，使试验菌悬 液浓度为5X 105cfu/ml-5X 106cfu/ml，倒平皿，15-20ml/皿，放置20mine使其凝固；
[0093] 2.用琼脂打孔器打孔，直径为5-6mm，4-5孔/皿，均匀分布，各样片中心之间相距 25mm以上，与平板的周缘相距15mm以上；
[0094] 3.样品浓度一般为100mg/ml (100mM);每孔加样品溶液20 y 1，盖好平皿，置于温 度37°C培养箱30-60min，使溶液完全被吸收，倒置培养16h-18h，用游标卡尺测量抑菌环的 直径并记录；
[0095] 4?评价
[0096] 抑菌作用的判断：抑菌环直径大于7mm者，判为有抑菌作用；抑菌环直径小于或等 于7mm者，判为无抑菌作用（表1):
[0097] 表多肽抗微生物活性结果
[0098]
【主权项】
1. 一种鹰嘴豆多肽部位的制备方法，其特征在于该方法中的原料为鹰嘴豆发芽除牙之 后的豆瓣或干燥的有机溶剂提取小分子化合物后的鹰嘴豆渣，具体操作按下列步骤进行： a、 取鹰嘴豆发芽除牙之后的豆瓣或干燥的有机溶剂提取小分子化合物后的鹰嘴豆渣， 粉碎后，按料液重量比为1 : 5加入石油醚，在室温下搅拌1 一 2小时，反复提取3-4次至 未有油脂提取出来为止，抽滤，合并沉淀，自然干燥至未有石油醚溶剂残留为止，得到脱脂 的鹰嘴豆粉； b、 将步骤a中充分脱脂的鹰嘴豆粉中加入50%乙醇，料液重量比为1 : 5,在室温下搅 拌提取2-3小时，每次提取3-4次，减压抽滤，合并提取液，分离杂物，得到多肽粗提取溶液 备用； c、 将步骤b中得到的多肽粗提取溶液，利用蒸馏水稀释至乙醇浓度为10%-20%，稀释的 提取溶液，上已用10%_20%的乙醇，流速为3毫升/MIN，在UV-280匪下进行洗脱平衡好的反 相C18硅胶柱，并用浓度为50%-80%乙醇洗脱，得到粗多肽部位： d、 将步骤c得到的粗多肽部位利用旋转蒸发仪浓缩至无乙醇溶液残留后，采用截留分 子量为IKDa的再生纤维素平板膜，浓缩过程中压力0. 15MPa，温度25°C，流速35m/s，浓缩倍 数为5-10倍，得到鹰嘴豆多肽浓缩物，依次经过离心，喷雾干燥或冷冻干燥，过筛，紫外灭 菌，包装，即可得到鹰嘴豆多肽粉。
2. -种如权利要求1所述方法获得的鹰嘴豆多肽粉在制备抗细菌、抗真菌生物活性的 药物中的用途。
3. -种如权利要求1所述方法获得的鹰嘴豆多肽粉在制备食品添加剂中的用途。
【专利摘要】本发明涉及一种鹰嘴豆多肽部位的制备方法及其应用，该鹰嘴豆多肽部位是由鹰嘴豆或利用有机溶剂提取小分子化合物后的鹰嘴豆渣，采用先粉粹脱脂，利用乙醇提取，C18反相柱层析纯化，最后由超滤膜技术制备总多肽部位，再利用现代喷雾干燥技术或冷冻干燥精制而成的鹰嘴豆多肽粉，该鹰嘴豆多肽粉部位被验证具有抗细菌和真菌活性。不但具有广泛的抗微生物活性，而且具有一定的抗氧化和降血糖活性，同时具有增强体液免疫及全身免疫的功能，富含人体易消化和吸收的纯天然植物来源多肽和蛋白质。该鹰嘴豆多肽粉部位的特点是既保留了鹰嘴豆多肽蛋白质的同时还实现变废为宝和资源充分利用的目的；该鹰嘴豆多肽粉作为天然抗菌剂、食品添剂或药物，可用于食品和医药行业。
【IPC分类】A61P31-04, C07K1-36, C07K1-34, A23L1-305, A61P31-10, A61K38-16, C07K1-20
【公开号】CN104761617
【申请号】CN201510191380
【发明人】阿布力米提·伊力, 阿吉艾克拜尔·艾萨, 艾合米丁·外力, 肖凯提·萨利赫
【申请人】中国科学院新疆理化技术研究所
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2015年4月21日