植物耐逆性相关蛋白及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，尤其设及一种植物耐逆性相关蛋白及其编码基因与应 用。
【背景技术】
[0002] 干旱是对农业的影响最为严重的非生物胁迫之一，能够严重影响作物的生长发 育，降低作物的产量。干旱具有影响范围广，持续时间长的特点，且随着全球气候变化，干旱 发生的频率、持续的时间和危害程度也在上升。我国是农业大国，又是世界上主要的干旱国 家之一。因此，研究干旱等非生物逆境的作用机制和植物对逆境信号反应的分子机制并结 合基因工程克隆和过表达植物应对非生物逆境胁迫相关的基因，可能提高转基因植物对干 旱等逆境胁迫的耐受性，为提高植物的抗逆性和农作物产量提供依据。
[0003] 植物激素脱落酸ABA是与水分胁迫相关的激素，在植株应对干旱、盐碱等非生物 胁迫及种子成熟、休眠等发育过程中发挥重要作用。ABA信号传导通路包含=个核屯、组 分，它们分别是PYR/PYL/RCAR(ABA受体）、2C类蛋白憐酸酶肿2C;负调控因子）、SNFl相 关蛋白激酶2(Sn服2 ;正调控因子）。它们组成了一个双重负调控系统：[PYR/PYL/RCAR- PP2C-ISn服2]。在没有ABA的情况下，PP2C通过解憐酸化抑制Sn服2的活性。当应答 来自环境或发育信号时，ABA促进PYR/PYL/RCAR与PP2C之间的相互作用，结果PP2C受到 抑制，如服2被激活，被激活的Sn服2获得激酶活性，可W憐酸化下游的转录因子，从而诱导 ABA应答基因的表达。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的是提供一种蛋白。
[000引本发明提供的蛋白，命名为化PYL9,是如下1)或2):
[0006] 1)序列表中序列2所示的蛋白质；
[0007] 2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且具有相同功能由序列2衍生的蛋白质。
[0008] 上述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸 残基的取代和/或缺失和/或添加。
[0009] 编码上述蛋白质的DNA分子也是本发明保护的范围。
[0010] 上述DNA分子是如下1) -4)中任一种的DNA分子：
[0011] 1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；
[001引 2)编码区为序列表中序列3所示的DNA分子；
[001引 3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；
[0014] 4)与1)或。限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至 少具有85 %、至少具有90 %、至少具有95 %、至少具有96 %、至少具有97 %、至少具有98 % 或至少具有99%同源性且编码具有相同功能蛋白质的DM分子。
[0015] 上述严格条件可为在6XSSC，0. 5%SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2XSSC， 0. 1 %SDS和 1XSSC，0. 1 %SDS各洗膜一次。
[0016] 含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护 的范围。
[0017] 转基因细胞不包括植物繁殖材料。
[0018] 扩增上述DNA分子全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围。
[0019] 上述蛋白、上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在如下 1)-5)中至少一种应用：
[0020] 1)在逆境胁迫下，调控植物种子萌发；
[0021] 2)调控植物对ABA敏感性（种子萌发期和根生长初期）；
[0022] 3)调控植物中ABA应答蛋白表达；
[0023] 4)调控植物抗逆性；
[0024] 5)与PP2C家族蛋白发生相互作用。
[00巧]所述PP2C家族蛋白为ABIl、ABI2、(ihPP2Cl或(ihPP2C2。
[0026] 上述应用中，所述抗逆性为植物苗期抗逆性，具体为植物苗期抗旱性；
[0027] 所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
[0028] 上述蛋白、上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在培育 具有如下1)-4)至少一种特征的植物中的应用也是本发明保护的范围：
[0029] 1)在逆境胁迫下，植物种子萌发滞后；
[0030] 2)植物对ABA敏感性提高；
[0031] 扣植物中ABA应答蛋白表达量提高；
[0032] 4)植物抗逆性提高。
[0033] 所述抗逆性为植物苗期抗逆性，具体为植物苗期抗旱性；
[0034] 所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物具体为十字花科植物；所 述十字花科植物具体为拟南芥。
[0035] 所述植物对ABA敏感性提高具体体现在植物在ABA胁迫下根长降低；
[0036] 所述ABA应答蛋白具体为畑29A和畑29B;
[0037] 本发明的另一个目的是提供一种培育具有如下1)-4)至少一种特征的转基因植 物的方法。
[0038] 本发明提供的方法，包括如下步骤：为将编码上述蛋白的DNA分子导入目的植物， 获得转基因植物，
[0039] 所述转基因植物具有如下1-4)中至少一种特征：
[0040] 1)在逆境胁迫下，所述转基因植物种子萌发滞后于所述目的植物；
[0041] 2)所述转基因植物对ABA敏感性高于所述目的植物；
[0042] 3)所述转基因植物中ABA应答蛋白表达量大于所述目的植物；
[0043] 4)所述转基因植物抗逆性高于所述目的植物。
[0044] 上述的应用或上述的方法中，
[0045] 所述抗逆性为植物苗期抗逆性，具体为植物苗期抗旱性；
[0046] 所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
[0047] 上述蛋白、上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在培育 具有如下1)-4)至少一种特征的转基因植物：
[0048] 1)在逆境胁迫下，所述转基因植物种子萌发滞后于所述目的植物；
[0049] 2)所述转基因植物对ABA敏感性高于所述目的植物；
[0050] 3)所述转基因植物中ABA应答蛋白表达量大于所述目的植物；
[0051] 4)所述转基因植物抗逆性高于所述目的植物；
[0052] 所述转基因植物为将编码上述蛋白的DNA分子导入目的植物，获得转基因植物。
[0053] 上述转基因植物对ABA敏感性高于所述目的植物体系在所述转基因植物在ABA胁 迫下根长小于所述目的植物；
[0054] 所述抗逆性为植物苗期抗逆性，具体为植物苗期抗旱性；
[00巧]所述ABA应答蛋白为畑29A和畑29B;
[0056] 所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物具体为十字花科植物；所 述十字花科植物具体为拟南芥。
[0057] 本发明的实验证明，本发明在棉花中发现一个新蛋白化PYL9,将其导入拟南芥中， 转基因植物的抗旱性高于目的植物，且对ABA的敏感性提高，证明该蛋白为抗旱蛋白，且对 ABA敏感，为培育抗旱植物提高基础；另外将其与PP2C家族蛋白反应，发现其可W与该家族 蛋白发生相互作用。
【附图说明】
[005引 图1为陆地棉化PYL9基因的克隆。
[0059] 图2为化PYL9基因转录区示意图。
[0060] 图3为化PYL9基因在棉花各组织表达情况。
[0061] 图4为化PYL9基因在ABA诱导条件下的表达情况。
[0062] 图5为过表达载体P化PYL9酶切鉴定及质粒电泳。
[0063] 图6为过表达载体P化PYL9转化的农杆菌鉴定。
[0064] 图7为化PYL9Tl代转基因拟南芥植株的PCR鉴定。
[0065] 图8为Ts代化PYL9转基因拟南芥萌发实验分析。
[0066] 图9为不同处理条件下野生型与转基因株系种子萌发率比较。
[0067] 图10为ABA处理条件下转基因株系和野生型生长情况比较。
[0068] 图11为ABA处理下的根长。
[0069] 图12为野生型和转基因型拟南芥中ABA应答基因的表达量分析。
[0070] 图13为干旱胁迫实验。
[0071] 图14为化PYL9与PP2C家族成员的相互作用分析
【具体实施方式】
[0072] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0073] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0074] 培养基：
[00巧]孤0:SD/-Leu/-T巧固体培养基
[0079] QD0/X/A配方：1LQDO培养基高压灭菌后，加入250yL0. 5mg/mLAbA至终浓度 125ng/mL。
[0080] QD0/X/A/ABA配方：ILQDO培养基高压灭菌后，加入250yL0. 5mg/mLAbA至终浓 度 125ng/mL，加入 2血 20mg/mLX-a-GAL至终浓度 40Jig/血）。
[0081] W上培养基配制好后，12rC，高压蒸汽灭菌15min，冷却到50°C-下可加入 0. 5mg/mLAbA(至终浓度 125ng/mL)与 20mg/mLX-a-GAL(至终浓度 40Jig/mL)。
[0082]实施例1、化PYL9基因的克隆
[008引一、化PYL9基因的克隆
[0084] 1、(ihPYL9 基因cDNA的克隆
[00财 提取陆地棉Y18(GossypiumhirsutumLY18 (刘东军，张锐，郭S堆， 等.棉花品系Y18在草甘麟胁迫下的epsps基因表达分析研究[J].中国生物工程杂 志，2008,（10) :55-59.)叶片的RNA，反转录得到CDNA作为模板，用引物(ihPYL9F/(；hPYL9R 为引物进行RT-PCR扩增，得到558bp的PCR扩增产物（图1A)。
[008引表1为引物序列 [0087]
阳08引经过测序，该PCR扩增产物具有序列表中序列1所示的核巧酸，其所示的基因命名 为化PYL9,化PYL