仿刺参凝集素基因、重组融合蛋白及制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于海洋生物基因工程领域，尤其涉及一种仿刺参凝集素基因、重组融合蛋白及制备方法。
【背景技术】
[0002]海参属棘皮动物们海参纲，约有1200多种，分布在我国海域的有140多种，其中品质最佳、药用价值最高的是产于中国辽宁、山东、河北等地的北太平洋沿海仿刺参(Apostichopus japonicus)0近些年来，海参已经成为东亚和东南亚地区重要的生态经济物种，在中国北部沿海地区海参养殖业也迅速发展起来。然而，由于海洋中含有高浓度病原菌导致海参养殖严重的病害问题，制约了海参养殖业的健康发展。通过提高海参天然免疫力来抵抗外来病原体的侵害是海参健康养殖最科学有效的途径。
[0003]海参的免疫系统中存在多种免疫因子，包括凝集素、抗菌肽、溶菌酶、模式识别受体和补体C3等，目前对于凝集素(Lectin)的研究最为广泛、透彻。凝集素是一类非免疫起源、非酶的、可促使细胞凝集的蛋白质或多价糖结合蛋白，其分子中含有一个或多个可与单糖或寡糖特异可逆结合的非催化的结构域，具有对糖、糖脂、糖蛋白高度亲和并专一结合的特性。凝集素具有识别细胞表面特异性糖结构的功能，并参与细胞凋亡、细胞粘附、促有丝分裂、跨膜信号转导和识别肿瘤细胞等生命活动。孙永欣等报道，海参体液中的凝集素具有修复伤口的作用；通过与外源细胞上的特异性糖结构相结合发挥凝集和调理杀伤作用。Cheung等研究表明，海洋物种中分离出来的凝集素具有高效的抗细菌、抗真菌、抗病毒、消炎、抗寄生物和抗癌变等多种活性，可见凝集素在海洋无脊椎动物的先天免疫中具有重要作用。然而，分离提取天然海参凝集素过程复杂、成本高，迄今为止还没有关于重组仿刺参凝集素基因、编码蛋白及制备方法的相关报道。
【发明内容】
[0004]本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种仿刺参凝集素基因、重组融合蛋白及制备方法。
[0005]本发明的技术解决方案是:一种仿刺参凝集素基因，其特征在于核苷酸序列如SEQID NO:1 所示。
[0006]一种如权利要求1上述仿刺参凝集素基因的重组融合蛋白，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0007]—种上述仿刺参凝集素基因的制备方法，其特征在于依次按如下步骤进行:
a.提取仿刺参总RNA;
b.将仿刺参总RNA 反转录合成 3’ -RACE-Ready cDNA 和 5’ -RACE-Ready cDNA ；
c.以3’-RACE-Ready cDNA为模板，用特异性引物Ajmbcl_3和UPM进行PCR反应，得到3’ -First round PCR产物，所述特异性引物Ajmbcl_3序列如下:
Ajmbcl-3:5’ GGACTGGCTTCAATGGAAAGTGTTA 3’ ； d.以3’-Firstround PCR产物为模板，用特异性引物Ajmbcl_n3和NUP进行PCR反应，得到3’ -ΝΕΤ-PCR产物，所述特异性引物Ajmbcl-n3序列如下:
Ajmbcl-n3:5’ ACAGTCGCGGGGCCATAGCATCGGG 3’ ；
e.以5’-RACE-Ready cDNA为模板，用特异性引物Ajmbcl_5和UPM进行PCR反应，得到5’ -First round PCR产物，所述特异性引物Ajmbcl_5序列如下:
Ajmbcl-5:5’ GATGTACACCTGTGGATCCCAACCG 3’ ；
f.以5’-Firstround PCR产物为模板，用特异性引物Ajmbcl_n5和NUP进行PCR反应，得到5’ -ΝΕΤ-PCR产物，所述特异性引物Ajmbcl-n5序列如下:
Ajmbcl-n5:5’ ATGACCACTGGCAAGAACATTACCT 3’ ；
g.将3’-ΝΕΤ-PCR产物和5’ -ΝΕΤ-PCR产物拼接得到完整凝集素基因片断。
[0008]本发明以所得到的完整凝集素基因片断为模板，用RT-PCR引物扩增出完整的凝集素基因片段，并将其连接到PMD19-T载体上，所得阳性克隆表达、纯化，即得到仿刺参凝集素重组融合蛋白rAj-MBCL。制备方法简单、纯化率高，所获得的仿刺参凝集素重组融合蛋白rAj-MBCL成本低、凝集活性高、表达量多、实验重复差异小、结果稳定、可控性强，可用于海参免疫增强剂的工业化开发，可以有效抑制海参病害问题，减少污染，建立健康的养殖环境。
【附图说明】
[0009]图1本发明实施例仿刺参凝集素目的基因的琼脂糖凝胶电泳检测图。
[0010]图2本发明实施例重组表达质粒的双酶切电泳鉴定图。
[0011]图3本发明实施例重组表达体系(pET32a-AjMBCL)表达产物的SDS-PAGE凝胶电泳及Western blot鉴定结果示意图。
[0012]图4本发明实施例仿刺参凝集素重组融合蛋白rAj-MBCL凝血活性分析结果示意图。
【具体实施方式】
[0013]a.提取仿刺参总RNA:
取仿刺参体壁lOOmg，用液氮研磨，加入lmlTRNzol -A+提取试剂(TIANGEN)，其余具体操作根据TIANGEN公司的TRNzol-A+总RNA提取试剂说明书进。
[0014]b.将仿刺参总 RNA 反转录合成 3’ -RACE-Ready cDNA 和 5’ -RACE-Ready cDNA。
[0015]c.以3’-RACE-Ready cDNA为模板，用特异性引物Ajmbcl-3和UPM进行PCR反应，得到3’ -First round PCR产物，所述特异性引物Ajmbcl-3序列如下:
Ajmbcl-3:5’ GGACTGGCTTCAATGGAAAGTGTTA 3’ 。
[0016]d.以3’ -First round PCR产物为模板，用特异性引物Ajmbcl_n3和NUP进行PCR反应，得到3’ -ΝΕΤ-PCR产物，所述特异性引物Ajmbcl-n3序列如下:
Ajmbcl-n3:5’ ACAGTCGCGGGGCCATAGCATCGGG 3’ ；
3’端核苷酸序列的获得:将3’ -ΝΕΤ-PCR扩增产物用EasyPure Quick GelExtract1n Kit纯化后与pMD19_T载体连接，送生物生工测序，获得仿刺参凝集素Aj-MBCL基因的3’端序列。
[0017]e.以 5’ -RACE-Ready cDNA 为模板，用特异性引物 Ajmbcl-5 和 UPM 进行 PCR 反应，得到5’ -First round PCR产物，所述特异性引物Ajmbcl-5序列如下: Ajmbcl-5:5’ GATGTACACCTGTGGATCCCAACCG 3’ ；
f.以5’-First round PCR产物为模板，用特异性引物Ajmbcl_n5和NUP进行PCR反应，得到5’ -ΝΕΤ-PCR产物，所述特异性引物Ajmbcl-n5序列如下:
Ajmbcl-n5:5’ ATGACCACTGGCAAGAACATTACCT 3’ ；
5’端核苷酸序列的获得:将5’-NET_PCR扩增产物用EasyPure Quick Gel Extract1nKit纯化后与pMD19-T载体连接，送生物生工测序，获得仿刺参凝集素Aj-MBCL基因的5’端序列。
[0018]g.将3’ -ΝΕΤ-PCR产物和5’ -ΝΕΤ-PCR产物拼接得到完整凝集素基因片断:
将3’-RACE获得的刺参凝集素Aj-MBCL基因的3’端序列及5’-RACE获得的仿刺参凝集素Aj-MBCL基因的5’端序列用Seqman软件进行拼接，得到完整的仿刺参凝集素Aj-MBCL基因核苷酸序列。经测序，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，含有的完整0RF，长为537bp。
[0019]一.基因扩增、克隆与重组质粒的构建:
1.以完整的凝集素基因片段为模板，用RT-PCR引物进行选择性扩增，所述RT-PCR引物如下:
mAjmbcF:5’ CCGGAATTCTGTACTTTGACGGCTTGTC 3’ EcoR ImAjmbcR:5’ CCCAAGCTTATTAAATTGATACACGGTG 3’ Hind III ；
将RT-PCR产物经过凝胶电泳检测后用EasyPure Quick Gel Extract1n Kit进行回收、纯化。琼脂糖凝胶电泳分析图如图1所示:图1中M:Marker (由上至下依次为2000，1000，750，500，250，100bp) ；1: Aj-MBCL 基因 PCR 扩增片段，477bp。
[0020]2.再用EcoR I和Hind III对纯化的RT-PCR产物及表达载体pET_32a ( + )进行双酶切，电泳回收目的条带，用T4 ligase (TaKaRa)连接，转化BL21 (DE3)感受态细胞，涂布LB (AMP+)琼脂平板，PCR鉴定阳性克隆。PCR鉴定正确者即为基因工程表达菌株，酶切电泳鉴定如图2所示。
[0021]图 2 中 M -Marker (由上至下依次为 8000，5000，3000，1500，1000，500bp)；
1:重组表达质粒(pET32a-Aj-MBCL) ；2:重组表达质粒(pET32a_Aj-MBCL)经双酶切。
[0022]以上PCR 反应用 buffer、dNTP 和酶由 TaKaRa LA