用于检测鱼类小清蛋白的荧光定量pcr方法及引物对的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及食品安全检测技术领域，具体涉及一种用于检测鱼类小清蛋白的荧光定量PCR方法及引物对。
【背景技术】
[0002]1969年，Aas和Elsayed首次鉴定出了太平洋鳕鱼(Gadus callarias)的主要过敏原并将其命名为Gad c 1，是世界上第一批被鉴定的食物过敏原之一。Gad c 1由113个氨基酸和1个葡萄糖分子构成，分子量约为12kD，属于小清蛋白，是一种钙结合蛋白，这种小清蛋白大量存在于低等脊椎动物的白色肌肉中。小清蛋白按照氨基酸序列的不同可分为两个不同的类型:α型小清蛋白pi彡5.0，含少量酸性小清蛋白，β型小清蛋白pi ( 4.5，酸性小清蛋白含量较高。鱼类中小清蛋白大部分属于β型。
[0003]鱼类小清蛋白之间具有很高的氨基酸序列同源性(60?90% )，接近70%的患者对不同鱼类的小清蛋白存在交叉反应。目前的鱼类小清蛋白的检测方法主要有血清学检验和蛋白质特性方法，其中，血清学方法(RAST，CAP等)都依赖于过敏患者的血清，而血清个体差异较大，此外，商业化的过敏原固相载体与IgE的结合能力也不尽相同，所以在食品过敏原检测的商业推广上有较大的难度；而基于蛋白特性的ELISA分析是在质量稳定的动物抗体基础上，特异性和灵敏性都不错，尤其对于深加工产品中热稳定蛋白的稳定性要高于DNA，但是要获得一高特异性的抗体比较困难。
[0004]为了解决上述技术问题，本发明提供一种以目前应用最成熟、操作最简便的PCR法(检测特异基因序列)为基础，建立多种鱼类及产品中致敏原的荧光定量PCR检测方法及引物对，提出了一种检测时间短、成本低、检测结果特异性好的用于检测鱼类小清蛋白的荧光定量PCR方法和引物对；不仅有利于适应食品加工领域实现脱敏、低敏食品生产的在线检测，从源头上降低过敏发生的可能性，还对农业、卫生及其他质量管理部门规范食品成分标识，保障食品安全具有重要作用。
【发明内容】
[0005]本发明目的在于克服现有基于蛋白的检测方法在某些食品检测中的局限性，提供一种检测时间短、成本低、检测结果特异性好的用于检测鱼类小清蛋白的荧光定量PCR方法和引物对。
[0006]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0007]检测鱼类小清蛋白的荧光定量PCR方法，具体包括以下步骤:
[0008]步骤一、根据编码鱼类小清蛋白基因序列的保守片段设计特异性扩增引物对；
[0009]步骤二、提取样品DNA，利用步骤一所得特异性扩增引物对采用SYBR荧
[0010]光定量PCR方法进行扩增；
[0011]步骤三、通过扩增曲线和溶解曲线判断样品是否含有小清蛋白基因。
[0012]较佳地，在步骤一中，所述引物对具体为序列SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2所示。
[0013]较佳地，在步骤二所述的荧光定量PCR方法中，PCR反应体系具体为:2X的SYBR Premix Ex Taq 10 μ 1，0.4 μ I的引物混合液，其上下游引物的浓度均为10 μM，ROXReference Dye II 0.4 μ I以及6.8 μ I的去离子水，DNA模板2 μ I ;其中，所述2X SYBRPremix Ex Taq反应液为Takara公司产品，目录号:RR420。
[0014]较佳地，在步骤二所述的荧光定量PCR方法中，PCR反应程序为:95°C 30s，I个循环；94°C 5s ；60°C 33s，单点采集荧光，SYBR green通道，40个循环；反应结束后，再进行一次 95。。15s，60°C lmin，95°C 15s，以绘制溶解曲线。
[0015]本发明还涉及检测鱼类小清蛋白的荧光定量PCR方法的引物对，该引物对具体为:鱼类小清蛋白引物的碱基序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2所示。
[0016]本发明采用上述技术方案所带来的技术效果在于:
[0017]本发明涉及一种用于检测鱼类小清蛋白的荧光定量PCR方法和引物对。本发明的方法检测速度快，灵敏度高，操作简单，检测成本低，与血清学和蛋白质特性检验相比，本发明不依赖于血清和抗体的获得；本发明的检测靶点是自行通过比较基因组学、生物信息学筛选并经过生物学验证而得到的，具有单一特异性，检测结果可靠，结果判定简单，可快速、灵敏、特异地检测食品中不同鱼种及制品中的过敏原成份一小清蛋白；有利于适应食品加工领域实现脱敏、低敏食品生产的在线检测，从源头上降低过敏发生的可能性，还对农业、卫生及其他质量管理部门规范食品成分标识，保障食品安全具有重要作用。
【附图说明】
[0018]图1为实施例1小清蛋白的荧光定量PCR方法检测结果示意图；
[0019]图2为实施例1小清蛋白的荧光定量PCR方法检测结果示意图；
[0020]图3为实施例2小清蛋白的荧光定量PCR方法检测结果示意图；
[0021]图4为实施例2小清蛋白的荧光定量PCR方法检测结果示意图。
【具体实施方式】
[0022]下面结合附图与【具体实施方式】对本发明作进一步详细描述:
[0023]实施例1:检测鲈鱼小清蛋白的实时荧光定量PCR方法，具体包括以下步骤:
[0024]步骤一，根据编码鱼类小清蛋白基因组DNA序列中的保守序列设计引物
[0025]通过氨基酸序列和编码基因序列的分析，由于鱼类小清蛋白有较好的保守性，因此根据该蛋白编码基因的特异性来设计引物。首先在GenBank中查找到不同鱼类的小清蛋白编码基因，比对分析后找出其保守区段，然后在GenBank中通过Blast软件将选取的保守区段与其它动物种类的DNA序列对比后，找到与其它物种DNA的非同源区域，用引物设计软件Primer Premier 5.0从中设计小清蛋白的特异性引物，引物序列如下(引物由大连宝生物工程有限公司):
[0026]5’ -TGCTGACTCCTTCffffCYACAAGWCCTTCTT-3’，(SEQ ID NO:1)
[0027]5’ -ACTCATCffAYTCCffATCTTGCCATCACCWTC-3?, (SEQ ID NO:2)
[0028]其中W和Y代表简并碱基，W代表A或T，Y代表C或T。
[0029]步骤二，基因组DNA提取
[0030]高盐法:用灭菌的手术刀片取150mg样品于1.5mL的离心管中，分别加入400 u L的 TE (含 lOmmol/L Tris-HCl 和 lmmol/L EDTA)、40uL 10%SDS 以及 lOuL 20mg/mL 的蛋白酶K，涡旋30s ;将离心管置于55-65°C的恒温水浴槽中消化5_6h，加入300 u L 6M饱和的NaCI溶液，祸旋30s, 12000r/min离心30min ;取上清液至新的1.5mL离心管中，加入等体积的酸/氯仿/异戊醇(25:24:1)，缓慢震荡lmin，12000r/min离心lOmin ;取上清液至新的离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)缓慢震荡至乳白色，12000r/min离心lOmin ;取上清液至新的离心管中，加入1/10体积3M NaAc, 2倍等体积乙醇，冰浴30min，12000r/min离心lOmin ;弃上清液，加入800 μ L 70%乙醇，12000r/min离心3min，重复两次，然后弃乙醇，在56°C的烘箱中烘干，然后加入50 μ L双蒸水，3-5 μ L 10mg/mL的RNAase溶液，56°C水浴30min，-20 °C下保存。
[0031]需要说明的是，上述为推荐的DNA提取方法，其它可达到PCR扩增质量要求的DNA提取方法均适用。
[0032]步骤三，荧光PCR检测方法的体系及反应参数
[0033]荧光PCR检测方法如下:
[0034]PCR反应体系(20 μ L)为:2倍定量PCR反应液10 μ 1，0.4 μ 1的引物混合液(上下游引物的浓度均为10yM)，R0X Reference Dye II 0.4 μ 1以及6.8 μ 1的去离子水，DNA模板2μ1。其中，所述2倍定量PCR反应液为Takara公司产品，名称为SYBR Premix ExTaq?，目录号:RR420。
[0035]PCR反应条件为:95°C 30秒，1个循环；94°C 5秒；60°C 33秒，(单点采集荧光，SYBR green通道)，40个循环。反应结束后，再进行一次95°C 15s，60°C lmin，95°C 15s，以绘制溶解曲线。
[0036]步骤四，检测结果分析
[0037]如图1、2所示，三条曲线表示的是3个重复鲈鱼样品出现阳性扩增曲线，Ct值分别为22.3,19.6,22.5，Tm值为86.1°C、86.3°C、86.1。阴性对照、阳性对照和空白对照结果均正常，据此可判定该样品检出过敏原蛋白，可靠性较高。
[0038]实施例2:利用实施例1的检测方法，对鸡肉、牛肉、驴肉、羊肉、鸭肉、猪肉6种非鱼类肉制品，和小黄鱼、大黄鱼、三文鱼、鲷鱼、红鱼柳、鳕鱼6种鱼肉制品进行小清蛋白基因检测，结果如图3、4所示(图中的1-12分别表示:1.鸡肉；2.牛肉；3.驴肉；4.羊肉；
5.鸭肉；6.猪肉；7.小黄鱼；8.大黄鱼；9.三文鱼；10.鲷鱼；11.红鱼柳；12.鳕鱼)，6种非鱼类肉制品全部为阴性；其余6种鱼肉制品检测结果均为阳性。
【主权项】
1.检测鱼类小清蛋白的荧光定量PCR方法，其特征在于包括以下步骤: 步骤一、根据编码鱼类小清蛋白基因序列的保守片段设计特异性扩增引物对； 步骤二、提取样品DNA，利用步骤一所得特异性扩增弓I物对采用SYBR荧光定量PCR方法进行扩增； 步骤三、通过扩增曲线和溶解曲线判断样品是否含有小清蛋白基因。2.根据权利要求1所述的检测鱼类小清蛋白的荧光定量PCR方法，其特征在于:在步骤一中，所述引物对具体为序列SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2所示。3.根据权利要求1所述的检测鱼类小清蛋白的荧光定量PCR方法，其特征在于:在步骤二所述的荧光定量PCR方法中，PCR反应体系具体为:2X的SYBR Premix Ex Taq 10 μ 1，0.4μ1的引物混合液，其上下游引物的浓度均为10yM，R0X Reference Dye II 0.4 μ 1以及6.8μ1的去离子水，DNA模板2μ1 ;其中，所述2XSYBR Premix Ex Taq反应液为Takara公司产品，目录号:RR420。4.根据权利要求1或3所述的检测鱼类小清蛋白的荧光定量PCR方法，其特征在于:在步骤二所述的荧光定量PCR方法中，PCR反应程序为:95°C 30s，1个循环；94°C 5s ；60°C 33s，单点采集荧光，SYBR green通道，40个循环；反应结束后，再进行一次95°C 15s，60°C lmin，95°C 15s，以绘制溶解曲线。5.检测鱼类小清蛋白的荧光定量PCR方法的引物对，其特征在于:该引物对具体为:鱼类小清蛋白引物的碱基序列如SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2所示。
【专利摘要】本发明涉及一种用于检测鱼类小清蛋白的荧光定量PCR方法及引物对，属于食品安全检测技术领域，所述PCR方法包括以下步骤：一、设计特异性扩增引物对；二、提取样品DNA；三、通过扩增曲线和溶解曲线判断样品是否含有小清蛋白基因；本发明还涉及一种引物对，该引物对具体为：鱼类小清蛋白引物的碱基序列如SEQ？ID？NO:1和SEQ？ID？NO:2所示。与现有技术相比，本发明利用生物信息学和比较基因组学，筛选到鱼小清蛋白的共有基因序列，并以此序列设计特异性扩增引物对，本发明的引物对待测样本进行荧光定量PCR检测，可快速、灵敏、特异地检测食品中不同鱼种及制品中的过敏原成份—小清蛋白。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105349540
【申请号】CN201510882721
【发明人】李可, 张晓峰, 张明哲, 朱晓雨, 方莹
【申请人】浙江省检验检疫科学技术研究院
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年12月3日