绿盲蝽感知伤害温度通道蛋白及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及昆虫基因工程技术领域，特别是设及一种绿盲睹感知伤害温度的通道 蛋白及其编码基因和应用。
【背景技术】
[0002] 农作物虫害严重影响农业生产，虫害严重发生时，不仅造成农作物大幅减产，而且 影响农产品品质，造成巨大的经济损失。自化学杀虫剂出现后，农业害虫的防治主要W化学 杀虫药剂为主。然而随着大范围高剂量化学杀虫药剂的使用，由此带来的弊端也日趋明显， 例如祀标害虫产生抗药性、杀死非祀标生物、污染环境、破坏生态系统等。因此，发展现代植 保技术，寻找新的祀标位点来发展高效、安全、环保的害虫防治新方法显得尤为迫切。
[0003] 绿盲睹属于半翅目盲睹科，其重要寄主设及棉花、绿豆、蚕豆、向日葵、首猜、苹果、 桃子、要、葡萄等28个科的作物，是我国农业生产中的重要害虫。近十年来，盲睹已在我国 由次要害虫上升为了主要害虫，在棉花、要、葡萄等多种作物生产上造成了严重危害。盲睹 作为昆虫中的一种属于变温动物，生长发育、繁殖、迁移、滞育等生命活动更易受到环境温 度变化的影响。研究表明，低温（18°C)抑制绿盲睹生殖腺的发育并延缓卵的成熟，高温则 抑制田间绿盲睹的种群密度。因此，通过调控绿盲睹温度感知对其种群或生长发育进行控 审IJ，进而有效防控绿盲睹对农作物的危害，是一项长期而艰巨的任务。
[0004] 生物总是躲避极端的温度并选择适宜的温度环境，快速、准确的感知环境温度的 变化已成为生物的基本生存能力。研究发现位于细胞膜及胞内细胞器膜上的一类非选择性 阳离子通道蛋白参与伤害温度感知。此类通道蛋白在某些昆虫外周神经元表达时，一方面 参与调控其躲避伤害温度、伤害性机械刺激及干燥的生存环境，另一方面有助于昆虫对来 自于某些植物挥发物产生厌恶反应。目前，对于此类通道蛋白，对于调控昆虫生理活动及其 行为活动的重要性显而易见，但是研究却主要集中于模式生物，尚未见针对绿盲睹中此类 通道蛋白基因序列、功能等方面的研究报道。由此可见，对于该通道蛋白基因的鉴定及功能 研究有助于阐明昆虫感知伤害温度的分子机制，从而很有可能使该通道蛋白及与其共同作 用的相关基因成为一种新的祀标基因，同时新基因的发掘将为转基因植物的培育和基因工 程杀虫剂的生产提供有效的基因来源，用来发展高效、安全、环保的害虫防治新方法控制农 业害虫的危害。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种绿盲睹感知伤害温度通道蛋白的 编码基因、功能及其应用。
[0006] 绿盲睹感知伤害温度通道蛋白DTRC通道蛋白，其特征在于：
[0007] (a)其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 1所示；或
[000引 化）在（a)中的氨基酸序列经过一个或者多个氨基酸残基的取代、缺失或者添加 且具有相同活性的由（a)衍生的蛋白质；或
[0009] (c)与SEQIDNO. 1具有至少90%序列同一性的氨基酸序列组成的蛋白。
[0010] 本发明的目的在于提供编码上述绿盲睹感知伤害温度通道蛋白的基因。
[ocm] 其中，所述基因的核巧酸序列如序列表SEQIDNO. 2所示。
[0012] 本发明的目的也在于提供含有上述基因的表达载体。
[0013] 本发明的目的也在于提供含有上表达载体的宿主。
[0014] 本发明的目的也在于提供含所述基因的转化植物细胞。
[0015] 本发明的目的也在于提供所述绿盲睹伤害温度通道蛋白在制备杀虫剂中的应用。
[0016] 本发明的目的也在于提供绿盲睹伤害温度通道蛋白在杀虫剂制备中作为祀标的 应用。
[0017] 本发明的目的还在于提供所述基因在杀虫剂制备中作为祀标的应用。
[001引本发明中的DTRC通道蛋白或其基因可W通过从半翅目盲睹科昆虫绿盲睹 (Apolyguslucorum)提取、基因工程或化学方法制备。
[0019] 本发明中利用生物信息学技术，分析了绿盲睹触角转录组，并获得了DTRC通道蛋 白的基因片段，W此片段设计正向和反向引物，进行3' -RACE,获得了该基因的3'端序列。 根据基因测序拼接获得DNA序列，在5'端和3'端非编码区重新设计一对引物DTRC-F与 DTRC-R，提取绿盲睹RNA并反转录成cDNA，W此cDNA为模板并进一步设计巢式引物来扩增 DTRC基因的全长序列进行测序验证。在此基因内重新设计一对引物，提取绿盲睹不同组织 RNA并反转录成cDNA，W该些cDNA为模板进行RT-PCR反应，获得该基因在绿盲睹不同组织 中表达谱，分析证明该基因在足中高水平表达。构建表达载体，对该基因利用爪赡卵母细胞 异源表达系统进行体外表达，结合双电极电压错技术，对该通道蛋白功能进行验证。并通过 绿盲睹行为学研究证明DTRC基因在绿盲睹感知环境温度伤害中发挥着重要作用。
[0020] 本发明中的绿盲睹感知伤害温度通道蛋白值TRC通道蛋白）在爪赡卵母细胞异源 表达系统中表现出在感知环境温度伤害中发挥着重要作用。因此可W利用此基因和RNAi 转基因植物的工作原理，用于转基因棉花育种。绿盲睹取食此转基因棉花后，其编码的蛋白 即此感知伤害温度通道蛋白功能受到影响，进而影响绿盲睹感知环境温度，导致其生存能 力下降，对棉花的抗绿盲睹育种将起到重要的促进作用。本发明中的基因或蛋白作为祀标 控制绿盲睹提供了理论基础，可W作为新的有效祀标来设计高效、安全、环保的化合物或者 发展新颖的物理防治措施来控制绿盲睹的危害。无论把该基因做成转基因作物或者杀虫药 剂，利用RNAi干扰原理，当绿盲睹取食该转基因作物或药剂后，其体内该基因受到干扰，使 基因功能丧失，因此蛋白表达受到影响。
【附图说明】
[0021] 图1为绿盲睹DTRC基因蛋白序列及结构不意图；
[002引其中阴影部分序列为预测的错蛋白重复序列（Ankl-Ank8);下划线序列为预测的 跨膜结构（TM1-TM6)。
[0023] 图2为绿盲睹DTRC基因不同龄期和组织表达谱分析；
[0024] 其中（A)为绿盲睹DTRC基因在不同龄期的表达谱分析柱状图；1-6代表1-5龄若 虫及成虫；炬）为绿盲睹DTRC基因在成虫不同组织的表达谱分析柱状图。
[0025] 图3为表达DTRC基因的爪赡卵母细胞对20-45°C温度刺激的反应检测图；
[0026] 其中（A)为对照组爪赡卵母细胞对20-45°C温度刺激的反应轨迹；炬）为表达 DTRC基因的爪赡卵母细胞对20-45°C温度刺激的反应；（C)为对照组和表达DTRC的爪赡 卵母细胞对20-45°C温度刺激反应的电流值；1为表达DTRC的爪赡卵母细胞对20-45°C温 度刺激反应的电流值图4为表达DTRC基因的爪赡卵母细胞对一系列温度刺激的反应检测 图；
[0027] 其中（A)、做分别代表对照及表达DTRC基因的爪赡卵母细胞对不同温度刺激的 反应轨迹，（C)为对照组和表达DTRC的爪赡卵母细胞对不同温度刺激的反应电流值，A代表 表达DTRC基因的爪赡卵母细胞对不同温度刺激的电流值；与对照相比，*表示差异显著，** 表示差异极显著。
[002引图5绿盲睹在不同温度区域的分布比例柱状分析图。
【具体实施方式】
[0029] 下面通过具体实施例进一步说明本发明。W下实施例用于说明本发明，但不用来 限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作 的修改或替换，均属于本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规 方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为市售常规生化试剂。
[0030] 实施例1DTRC蛋白及其编码基因的发现、获得和分离
[0031] 1.DTRC基因的生物信息学分析
[0032]利用生物信息学技术及软件对绿盲睹转录组数据进行初步的分析，筛选到绿盲睹 DTRC基因cDNA的序列片段。
[0033] 2.供试昆虫及组织收集
[0034] 绿盲睹在中国农业科学院植物保护研究所使用新鲜玉米狂eamaysL)及四季豆 任]1336〇1113￥111肖31'13 1.)饲养，饲养温度为25-28°0，相对湿度为60%-70%，光照为 16:8(L:D)。取绿盲睹不同龄期的全虫（晚皮24小时内），成虫的触角、头、瞭、足、腹、翅等 组织，置于-70°C冰箱等待使用。
[00对3.RNA的提取
[0036] 昆虫总RNA提取的全部过程在无RNA酶条件下进行。整个提取步骤如下所示：
[0037] 1)取-70°C保存的昆虫组织，加入已经用液氮预冷的玻璃匀浆器中，立即向匀浆 器内加入1血Trizol试剂，将组织充分研磨磨碎；将研磨好的组织溶液用无RNA酶的枪头 转移到无RNA酶的1. 5mL离屯、管中，暂时至于冰上。
[003引 2)4°C，12000g离屯、15min，将上清转移到新的无RNA酶的1. 5mL离屯、管中。
[0039]如将上清在室温下放置5min后，向离屯、管中加入0.2血氯仿，用手剧烈震荡15s， 再室温静置2-3min。