口蹄疫病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒的制作方法
【专利说明】口歸疫病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒
[0001] 本申请为对申请号为201310351271. 7专利申请的分案申请技术领域
[0002] 本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明设及一种口蹄疫病毒结构蛋白抗体 酶联免疫检测试剂盒，特别是口蹄疫病毒结构蛋白VP1抗体酶联免疫检测试剂盒。
【背景技术】
[0003] 口蹄疫（Foot-and-MouthDisease,FMD)是世界范围内广泛分布，在国际间传播蔓 延的全球性流行性传染病。国际兽医局（01巧在1984年修订的动物传染病分类中将口蹄疫 列为A类传染病之首。口蹄疫是由口蹄疫病毒（Foot-and-MouthDiseaseVirus，FMDV)感 染引起偶蹄动物的一种高度接触性人畜共患传染病。其特点是发病急、传播快、传染率高， 造成畜群生产性能迅速下降，给畜牧业生产造成巨大经济损失，严重制约经济发展。口蹄疫 发病的主要症状为：口腔粘膜、舌、唇、鼻镜、蹄叉、乳头等部位发生水瘤，破溃形成烂斑，病 畜蹄痛、严重者蹄壳边缘溃裂或脱壳。不同动物的症状稍有不同，妊娠母牛可能流产，而后 导致繁殖力降低；猪则W破蹄为最主要症状；山羊和绵羊的症状通常比牛温和。口蹄疫传 染性高，传播迅速，感染猪、牛、羊等牲畜常导致幼畜死亡，成年动物生产能力急剧下降，严 重危害畜牧业的发展和畜产品的生产供应。同时会引发流行国家或地区动物及动物产品的 市场流通，并使其国际贸易受到及大的封锁和限制，给流行国家和地区的畜牧业生产造成 了巨大经济的损失。因此口蹄疫历来受到各国政府的高度重视。
[0004] 口蹄疫病毒属于小核糖核酸病毒科，口蹄疫病毒属。由"假"20面体对称的衣壳和 病毒核酸构成，该病毒粒子的整个外形是球形，不是严格的正20面体。完整的病毒颗粒包 括衣壳和RNA两部分，衣壳由VP1，VP2,VP3和VP4等4种结构蛋白各60个分子组成。研究 表明，结构蛋白VP1是诱导产生中和抗体的主要成分，它暴露在病毒粒子的表面。
[0005] 目前，口蹄疫的防治主要依靠疫苗免疫。我国对口蹄疫施行强制性免疫，每年春秋 进行一次集中免疫，两次之间对新补栏家畜及时进行补免。在实际生产中如何鉴别诊断易 感动物是进行了疫苗免疫还是感染了口蹄疫病毒对口蹄疫防疫体系的建立、检验检疫都是 十分重要的。世界各国也在该领域开展了广泛的研究。ELISA方法具有特异、敏感、快速、简 便、可靠性好等特点，且能自动化操作，并能迅速的检测大量样品，在FMD的诊断中日益受 到人们的重视，现已成为国际上检测易感动物猪、牛等是否疫苗免疫或感染病毒的常规方 法之一。
[0006] 口蹄疫是关系到国家经济安全的重大动物疫病，相关关键技术应该牢牢掌握在自 己手里。一旦我们拥有自主知识产权，将利于保障我国的经济安全。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种新的用于诊断口蹄疫易感动物猪是否感染口蹄疫病毒 的口蹄疫病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒。
[0008] 本发明还提供提供口蹄疫病毒结构蛋白VPl抗原表位多肤，为由序列表中序列1 所示的多肤或者序列表中序列2所示的多肤。
[0009] 本发明的口蹄疫病毒结构蛋白抗体酶联免疫检测试剂盒，包括口蹄疫病毒结构蛋 白VP1抗原表位多肤包被的酶联反应板和酶标记抗抗体；所述口蹄疫病毒结构蛋白VP1抗 原表位多肤为序列表中序列1所示的多肤和序列表中序列2所示的多肤。
[0010] 所述序列表中序列1所示的多肤和序列表中序列2所示的多肤的质量比为 0. 5-2. 0 : 1，优选为1 : 1。所设及的包被抗原采用固相化学合成的方法生产，包被抗原含 有口蹄疫病毒结构蛋白VP1的主要抗原位点，可与口蹄疫病毒感染后产生的结构蛋白VP1 抗体特异结合。
[0011] 所述酶标记抗抗体的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磯酸酶；所述酶标记抗抗体 为酶标记兔抗猪IgG;所述酶标记抗抗体优选为辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG，更优选 为辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG多克隆抗体）。
[0012] 所述酶联反应板为可拆卸96孔酶标板；所述口蹄疫病毒结构蛋白VP1抗原表位多 肤为化学人工合成得到。
[0013] 所述口蹄疫病毒结构蛋白VP1抗原表位多肤包被的酶联反应板的板的最佳制备 条件是；将所述口蹄疫病毒结构蛋白VP1抗原表位多肤溶于100y1的抑9. 4的碳酸盐溶 液，然后加到96孔聚苯己締酶联反应板，每孔50ng抗原，在37°C放置2-4小时，再4-8°C下 放置过夜使多肤抗原与酶联反应板充分结合，然后按照300 ^1/孔加入含有1 % (g/ml)牛 血清白蛋白抑7. 4的PBS缓冲液，37°C封闭处理1-2小时，洗漆后甩干，待酶联反应板干燥 后4 °C密封保存。
[0014] 所述试剂盒中含有显色液和终止液；当标记酶为辣根过氧化物酶时显色液由显色 液A液和显色液B液组成，所述显色液A液为含0.05% (g/ml)过氧化氨尿素的巧樣酸磯酸 盐缓冲液，所述显色液B液为0.02% (g/ml)的四甲基联苯胺溶液；当标记酶为碱性磯酸酶 时，显色液为4-硝基酪磯酸盐缓冲液；所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。
[0015] 所述试剂盒还包括阴性对照血清、阳性对照血清；所述阴性对照血清为用无口蹄 疫抗体的正常猪血清；所述阳性对照血清为W所述口蹄疫病毒结构蛋白VP1抗原表位多肤 为免疫原免疫猪得到的血清；
[0016] 所设及的阳性对照血清是具体是已上述人工化学合成的包被抗原作为免疫原，免 疫25-35日龄无特定病源体（SP巧猪，制备高免血清，加入lOOOU/ml链霉素和lOOOU/ml青 霉素，过0. 2ym滤膜除菌，作为试剂盒的阳性对照血清。
[0017] 所设及的阴性对照血清是用无口蹄疫抗体的正常猪血清，加入lOOOU/ml链霉素 和lOOOU/ml青霉素，过0. 2ym滤膜除菌，作为试剂盒阴性对照血清。
[0018] 所述试剂盒还包括样品稀释液和浓缩洗漆液；样品稀释液为含有3% (g/ml)BSA 的0. 15M、抑为7. 4的PBS缓冲液（过0. 45ym滤膜）；浓缩洗漆液；0. 01M，抑7. 4,含有 0.8%~1.2% (ml/ml)Tween-20和0.05% (g/ml)叠氮钢防腐剂的磯酸盐缓冲液（经过 0. 2ym滤膜除菌）。
[0019] 所述试剂盒还包括说明书，所述说明书可W记载如下内容：
[0020] 本发明试剂盒的检测程序为：
[0021] 1、平衡；将保存在4°C的试剂盒取出，平衡至室温备用；液体试剂用前混匀。
[0022] 2、配液；将浓缩洗漆液用蒸馈水或去离子水20倍稀释得到洗漆缓冲液；
[0023] 3、设定；留1个空白孔，3个阴性对照孔，和2个阳性对照孔，其余为待测样本孔。
[0024] 4、待测标本预稀释；使用样品稀释液将待检样品血清、阴性对照血清、阳性对照血 清按照1 : 21的比例稀释；往稀释板孔内每孔加lOOyl样本稀释液，分别加入5yl待测 样本。
[0025] 5、加样谊白孔不加样；3个阴性对照孔各加100y1阴性对照，2个阳性对照孔各 加 100y1阳性对照；其余孔分别按预先设定加100y1稀释的待测样本。加样过程时间跨 度应尽量短。
[002引 6、温育；震荡混匀，置37°C温箱或水浴锅中，反应30分钟。
[0027] 7、洗板；弃去反应液，每孔加300y1步骤2中得到的洗漆缓冲液，浸泡15秒，甩弃 洗液。连续洗板4次后拍干。
[0028] 8、加酶；空白孔不加酶；其余各孔加100y1辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG。
[002引 9、温育遺37°C温箱或水浴锅中，反应30分钟。
[0030] 10、洗板；弃去反应液，每孔加入稀释后的洗漆缓冲液300 ^1，浸泡15秒，甩弃洗 漆液。连续洗板5次后拍干。
[0031] 11、显色每孔分别加入100y1的底物显色液（其中溶液I和溶液II的W体积比 为1 : 1的比例混合）。加盖，37°C恒温箱里反应15min;
[0032] 12、每孔分别加入50y1终止液终止反应，混匀；
[0033] 13、测