一种固相合成制备醋酸辛卡利特的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于多肽药物制备方法技术领域，特别涉及一种固相合成制备醋酸辛卡利 特的方法。
【背景技术】
[0002] 中文名：醋酸辛卡利特
[0003] 英文名：Sincalide Acetate
[0004] 结构式：Asp_Tyr (SO3H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2
[0005] 分子式：C49H62NltlO16S3
[0006] 分子量：1143. 27
[0007] 醋酸辛卡利特（Sincalide Acetate)，又称辛卡利特（Sincalide)，是一种人工合 成的胆囊素八肽（Octapeptide)，主要用于促胆囊收缩，胆囊诊断试剂，临床用于治疗慢性 胰腺炎，发现胰分泌功能明显改善，症状明显减轻。徐满英（哈尔滨医科大学生理教研室， 哈尔滨，150086)通过大鼠实验得出，辛卡利特的抗电针镇痛作用在中枢痛反应神经元电活 动和整体行为反射水平上是协调一致的，表明辛卡利特能有效提高临床针刺的镇痛疗效。
[0008] 目前国内外关于辛卡利特的合成报道不多，市场上辛卡利特的制备方法主要是酶 解法和液相液相法。常见工艺中，采用了氨解的方法制备辛卡利特粗品，其中氨水有毒，对 目艮、鼻、皮肤有刺激性和腐蚀性，能使人窒息，与酸中和反应产生热，有燃烧爆炸危险。检测 反应中用到有毒试剂吡啶，吡啶易燃，有强烈刺激性，能麻醉中枢神经系统，对眼及上呼吸 道有刺激作用，长期吸入会出现头晕、头痛、失眠及消化道功能紊乱。
[0009] 上述辛卡利特制备方法中，都用到了毒性较大的试剂，若用于辛卡利特的大量制 备，定会长期接触此类试剂，对人身体伤害较大；且工艺操作复杂，制备周期长，酸解产生较 多副产物，生产成本昂贵，收率低，不利于工业生产、应用价值不高。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种纯度高，收率高的固相合成制备 醋酸辛卡利特的方法。
[0011] 本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
[0012] 一种固相合成制备醋酸辛卡利特的方法，该方法包括以下顺序的制备步骤：
[0013] (1)、将溶胀、脱保护并洗涤后的氨基树脂与活化的保护氨基酸溶液于30°C的恒温 震荡器中反应40-90min，依次接入从树脂端起第1-8个氨基酸相对应的保护氨基酸，得到 辛卡利特前体肽I -氨基树脂：
[0014] Fmoc-Asp-Tyr (SO3H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-氨基树脂：
[0015] (2)、将上述制得的辛卡利特前体肽I -氨基树脂脱保护并洗涤后抽干至颗粒状， 加入切割试剂，进行切割反应、沉降后，得到辛卡利特粗肽II :
[0016] Asp-Tyr (SO3H) -Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2;
[0017] (3)、将辛卡利特粗肽II溶于溶剂中，经反相高效液相色谱法纯化得到辛卡利特多 肽，冻干得到辛卡利特纯品III;
[0018] (4)、将辛卡利特纯品III用1 %醋酸溶解，采用强阴离子交换树脂室温搅拌吸附，之 后将吸附液补加醋酸，经冻干得到醋酸辛卡利特IV。
[0019] 步骤（1)中所述的氨基树脂为Rink Amide-MBHA Resin，其取代度为0· 35~ 0. 5mmol/g ;所述的溶胀是指将氨基树脂浸没在DCM溶剂中2h。
[0020] 步骤（1)中活化的保护氨基酸溶液制备方法为：将保护氨基酸和HOBt加入到离心 管中，加入DMF将其溶解，再用滴管向溶液中加入DIC，混合使其完全溶解得到活化的保护 氨基酸溶液。
[0021] 步骤（1)中所述的保护氨基酸为：Fmoc-Phe-〇H、Fmoc-Asp (otBu)-OH、 Fmoc-Met-OH、Fmoc-Trp (Boc)-OH、Fmoc-Gly-〇H、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Tyr(SO3H)-OH. Na、 Fmoc-Asp(otBu)-OH。
[0022] 步骤（I)和步骤（2)中所述的脱保护并洗涤是指：将溶液抽干后，加入1/3-1/2反 应器体积的20%哌啶/DMF溶液，置于30r/min的脱色摇床上振摇反应20min，然后用真空 泵将溶液抽干；再加入1/3-1/2反应器体积的DMF溶液，置于脱色摇床上振摇lmin，用真空 泵将溶液抽干，再次加入DMF溶液洗涤树脂，重复操作3次。
[0023] 步骤（2)中所述的切割试剂 100mL 配置为：94ml TFA+2. 5ml TIS+2. 5ml H2CHlml EDT ;切割反应条件为：置于20r/min的脱色摇床上，于-20°C条件下切割反应20min ;所述 的沉降选用-20°C低温预冷的无水乙醚，离心沉降3次。
[0024] 步骤（3)所述的溶剂为15%乙腈和水的混合溶液。
[0025] 步骤⑶所述的纯化选用C18, 5um制备柱进行反相高效液相色谱纯化，以 B. Cone/% (2 - 80)，0 - IOOmin的梯度程序，9ml/min的流速进样多肽的分离提纯。
[0026] 步骤（4)所述的强阴离子交换树脂为氯型强阴离子交换树脂；室温搅拌吸附lh， 之后将吸附液补加醋酸含量到5%。
[0027] 本发明还提供一种按照上述方法制备的醋酸辛卡利特纯品。
[0028] 本发明的有益效果：本发明利用Fmoc固相合成原理，开发了固相合成技术，采用 常见易得、低成本的试剂合成制备，通过工艺优化，辛卡利特粗品收率高达92%以上，其纯 品得率达到30-40%，大大提高了辛卡利特的得率；本发明还采用强阴离子交换树脂-醋酸 转盐技术处理辛卡利特纯品，大大降低了纯品中三氟醋酸的含量，彻底清除了三氟醋酸对 生物体的毒性；本发明操作简单，反应过程取样方便，易于中控，并且合成周期短，生产成本 低，副产物少，产品收率高，利于工业化生产。
【具体实施方式】
[0029] 为了便于本领域技术人员理解，下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0030] 本发明固相合成制备醋酸辛卡利特，以氨基树脂为起始树脂载体，氨基树脂为 Rink Amide-MBHA Resin，其取代度为0. 35~0. 5mmol/g ;通过固相合成法依次缩合辛卡利 特氨基酸序列中相对应的Fmoc-保护氨基酸，经活化剂和缩合剂缩合反应及脱保护剂的脱 保护反应，得到辛卡利特前体肽I -氨基树脂，之后脱掉天冬氨酸的Fmoc保护基，洗涤树脂 并进行切割、沉降后，得到辛卡利特粗肽II，粗肽经过纯化及冻干后得到辛卡利特纯品III。
[0031] 固相合成法依次缩合的Fmoc-保护氨基酸为：Fmoc-Phe-〇H、Fmoc-Asp (otBu) -OH、 Fmoc-Met-OH、Fmoc-Trp (Boc)-OH、Fmoc-Gly-〇H、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Tyr(SO3H)-OH. Na、 Fmoc-Asp (otBu) -OH，缩合反应中氨基酸投料量为所投氨基树脂摩尔数的2-4倍，缩合反应 温度为20-40°C。缩合反应所使用的活化剂和缩合剂分别为DIC、HOBt，缩合反应时间为 2〇-5〇11^11;脱保护剂为20%哌啶/1)1^的混合溶液，洗脱时间为15-3〇1^11。
[0032] 转盐工艺中所选用的转盐树脂为氯型强阴离子交换树脂，将辛卡利特纯品III用醋 酸溶解后加入到活化后的树脂中，搅拌吸附反应，替换出辛卡利特中的三氟醋酸盐，将反应 液冻干得到醋酸辛卡利特IV纯品。
[0033] 实施例1
[0034] 氨基树脂的溶胀：称量取代度为0. 38mmol/g的Rink-MBHA-Resin 0. lg，从开口端 加入至多肽合成反应器中，取DCM试剂加入至反应器中，使树脂完全浸没在DCM溶剂中，与 溶剂充分接触，溶胀2h。
[0035] UFmoc-辛卡利特树脂的合成 [0036] 辛卡利特前体肽I -氨基树脂为：
[0037] Fmoc-Asp-Tyr (SO3H) -Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-氨基树脂
[0038] 本实施例使用的保护氨基酸从树脂起算第1-8个氨基酸相对应的保护氨基酸及 分子量如下表1所不：
[0039] 表 1
[0040]
[0041] 本发明中一些常用的缩写具有以下含义：
[0042]
[0044] 保护氨基酸的活化方法
[0045] 以Fmoc-Phe-氨基树脂的缩合为例，按照计算的理论投料量称取24. 02mg Fmoc-Phe-OH和12. 57mg HOBt于离心管中，加2ml DMF将其溶解，再用滴管向溶液中加 IOul DIC，混合均匀得到活化的保护氨基酸溶液。
[0046] 树脂的脱保护以及洗涤方法
[0047] 将氨基树脂溶液抽干后，加入1/3-1/2反应器体积的20 %哌啶与DMF混合溶液， 置于30r/min的脱色摇床上振摇反应20min，然后用真空泵将脱保护溶液抽干；再加入 1/3-1/2反应器体积的DMF溶液，置于脱色摇床上振摇lmin，用真空泵将溶液抽干，再次加 入DMF溶液洗涤树脂，重复操作3次。
[0048] 茚三酮显色检测合格后，将上述的保护氨基酸溶液加到抽干的反应器中，再将反 应器置于30°C的恒温震荡器中反应20-50min。采用上述同样方法，依次接入第2-8个氨基 酸对应的Fmoc-保护氨基酸，即得到辛卡利特前体肽I -氨基树脂。
[0049] 2、辛卡利特粗肽II的合成
[0050] 将辛卡利特前体肽I -氨基树脂溶液抽干后，加入1/3-1/2反应器体积的20%哌 啶与DMF混合溶液，置于30r/min的脱色摇床上振摇反应20min，然后用真空泵将溶液抽干； 再加入1/3-1/2反应器体积的DMF溶液，置于脱色摇床上振摇lmin，用真空泵将溶液抽干， 再次加入DMF溶液洗涤辛卡利特前体肽I -氨基树脂，重复操作3次。
[0051] 将反应器中的树脂用真空泵抽干至颗粒状，配置IOml切割试剂：9.4ml TFA+O. 25ml TIS+O. 25ml H20+0.1 ml EDT，加入到反应器中，反应器置于20r/min的脱色摇 床上，于-20°C条件下切割反应20min。多肽的沉降选用-20°C低温预冷的无水乙醚，离