醋酸阿托西班杂质、制备及检测方法
【专利摘要】本发明涉及醋酸阿托西班杂质、制备及检测方法。杂质为杂质A、杂质B、杂质C、杂质D或杂质E，序列如下：杂质A：c[Mpa(S＝O)-D-Tyr(Et)-Ile-Thr-Asn-Cys]-Pro-Orn-Gly-NH2、杂质B：c[Mpa-D-Tyr(Et)-Ile-Thr-Asn-Cys(S＝O)]-Pro-Orn-Gly-NN2、杂质C：c[Mpa-D-Tyr(Et)-Ile-Thr-D-Asn-Cys]-Pro-Orn-Gly-NH2、杂质D：c[Mpa-D-Tyr(Et)-Ile-Thr-Asp-Cys]-Pro-Orn-Gly-NH2杂质E：c[Mpa-D-Tyr(Et)-Ile-Thr-Asn-Cys]-Pro-Orn-Gly-OH。所述杂质A、杂质B、杂质C、杂质D或杂质E可作为醋酸阿托西班合成过程中产生的工艺杂质或者降解杂质的可靠对照，可用于醋酸阿托西班合成中的杂质定性和定量的分析，为进一步控制醋酸阿托西班的质量开通了道路。
【专利说明】
醋酸阿托西班杂质、制备及检测方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种活性多肽杂质及其制备方法，尤其涉及醋酸阿托西班杂质、制备 及检测方法。
【背景技术】
[0002] 阿托西班，英文名:Atosiban，阿托西班是一个九肽，肽链中包含三个非天然氨基 酸D-Tyr(Et)，Mpa和Orn及一对在Mpa与Cys之间成环的二硫键，其结构式为：
[0003 ] c[Mpa-D-Tyr(Et)-Ile-Thr-Asn-Cys]-Pr〇-〇rn-Gly-NH2 〇
[0004] 阿托西班是一种可以直接与催产素竞争催产素受体，抑制催产素和催产素受体结 合，从而直接抑制催产素作用于子宫，抑制子宫收缩;也可以抑制磷脂酰肌醇的水解作用， 阻断第二信使的生成以及Ca 2+的活动，从而间接抑制子宫对催产素的反应，使子宫收缩得到 抑制。
[0005] 阿托西班在药品中以醋酸盐的形式存在，通用名为醋酸阿托西班。醋酸阿托西班 是一种合成多肽，是子宫催产素受体的竞争性拮抗剂，在早产治疗中已发展成为一种新的 宫缩抑制剂。可以延迟分娩，使母亲有足够的时间服用类固醇促使胎儿肺成熟。醋酸阿托西 班是催产素拮抗剂，代表一种新的抗分娩药。
[0006] 目前，关于醋酸阿托西班的合成，包括固相合成和液相合成，技术上均较为成熟， 但在合成过程中，由于合成步骤较多，加入的原料数量较多，造成产物杂质种类比较多，已 知的杂质包括 ：[Gly9-0H]_阿托西班、[Asp5-0H]-阿托西班、[D-Asn 5]-阿托西班等，产生的 未知工艺杂质和降解杂质还有很多，值得仔细研究。而且多肽合成过程中产生的许多工艺 杂质和降解杂质，与主成分结构极为相似，这些杂质如果控制不好，有可能产生严重的毒副 作用。
[0007] 杂质研究是药物质量研究的一项重要内容，是药物质量保证的关键因素之一。因 此为了提高临床用药安全，对合成过程中产生的杂质和降解杂质进行了详细的研究，在研 究中通过分析发现了新的杂质。因此，确定醋酸阿托西班所含的新的杂质结构并合成之，对 于醋酸阿托西班杂质的相关研究意义重大，是提高醋酸阿托西班药品质量急需的问题，也 是解决醋酸阿托西班合成过程中产生的工艺杂质或者降解杂质的可靠对照。它可以用于醋 酸阿托西班合成中的杂质定型和定量的分析，从而可以提高醋酸阿托西班的质量标准，有 效地保障和控制醋酸阿托西班的质量，对醋酸阿托西班原料药的质量研究以及制剂研究有 重要应用价值，为安全用药提供重要的指导意义。
【发明内容】
[0008] 本发明所要解决的技术问题是提供一种醋酸阿托西班杂质及其制备方法，该方法 简单，原料易得，产品容易纯化，纯度较高，能作为杂质检测中的对照品使用，为进一步控制 醋酸阿托西班的质量开通了道路。
[0009] 为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
[0010] 醋酸阿托西班杂质，其特征在于，所述的醋酸阿托西班杂质为杂质A、杂质B、杂质 C、杂质D或杂质E，其结构序列分别为：
[0011] 杂质A: c[Mpa(S = 0)-D-Tyr(Et)-Ile-Thr-Asn-Cys]-P;r〇-0;rn-Gly-NH2;
[0012] 杂质B: c[Mpa-D-Tyr(Et)-Ile-Thr-Asn-Cys(S = 0) ]-Pr〇-〇rn-Gly-NN2;
[0013] 杂质C: c[Mpa-D-Tyr(Et)-Ile-Thr-D-Asn-Cys]-P;r〇-〇;rn-Gly-NH2;
[0014] 杂质D: c[Mpa-D-Tyr(Et)-Ile-Thr-Asp-Cys]-P;r〇-〇;rn-Gly-NH2;
[0015] 杂质E: c[Mpa-D-Tyr(Et)-Ile-Thr-Asn-Cys]-P;r〇-〇;rn-Gly-〇H〇 [0016]本发明还提供上述杂质A、杂质B、杂质C、杂质D或杂质E的制备方法。
[0017] 具体地说，本发明所述的醋酸阿托西班杂质A或杂质B的制备方法包括如下步骤：
[0018] 1)将醋酸阿托西班原料药采用双氧水氧化，得到氧化后的溶液；
[0019] 2)将氧化后的溶液过滤后采用反相C18柱进行分离纯化，分离纯化时，每次上样量 为10ml，以乙腈为流动相A，0.05 %TFA/H20为流动相B，检测波长为220nm，15 %流动相A保持 lOmin，在lOmin到50min内流动相A变为45 %，分别收集36_39min组分或40_43min组分，再分 别经浓缩、冻干后得到所述的醋酸阿托西班杂质A和杂质B。
[0020] 上述制备方法中，步骤1)中所述的醋酸阿托西班原料药与双氧水的质量体积比为 lg: 5~15ml，优选lg: 10ml;所述的氧化时间为1~3h，优选2h;所述的双氧水为质量百分比 为30 %的双氧水;所述的醋酸阿托西班原料药在采用双氧水氧化前先用高纯水超声溶解； 步骤2)中所述的浓缩为在35~45 °C、优选在40 °C下浓缩。
[0021] 采用本发明的方法制得的醋酸阿托西班杂质A和杂质B的纯度达99.9%，可作为醋 酸阿托西班合成过程中产生的工艺杂质或者降解杂质的可靠对照，可用于醋酸阿托西班合 成中的杂质定性和定量的分析，为进一步控制醋酸阿托西班的质量开通了道路。
[0022] 本发明所述的醋酸阿托西班杂质C的制备方法包括如下步骤：
[0023] 1)以Fmoc-Gly-Rink Amide AM树脂为起始物料，溶胀后脱除Fmoc保护，得到Gly- Rink Amide AM树脂；
[0024] 2)以Gly-Rink Amide AM树脂为载体，以DIC/HOBT为缩合试剂，按照Fmoc/tbu固相 多肽合成的方法在Gly-Rink Amide AM树脂上偶联Fmoc-〇rn(Boc)-〇H;
[0025] 3)再按照上述方法依次偶联?111〇(3-?1'〇-〇!1、？1]1〇(3-〇5^(1'1'1:)-〇!1、？1]1〇(3-〇-4811(1'1'1:)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-〇H、Fmoc-Ile-〇H、Fmoc-D-Tyr(Et)-〇H、Mpa(T;rt)-〇H;
[0026] 4)用碘进行固相环化；
[0027] 5)用裂解试剂进行切割得醋酸阿托西班杂质C粗肽，用乙醚沉淀粗肽；
[0028] 6)用反相高效液相色谱法纯化分离，再经浓缩、冻干后即得所述的醋酸阿托西班 杂质C。
[0029] 进一步，步骤1)中Fmoc-Gly-Rink Amide AM树脂的取代度为0.3~1 .Ommol/g。
[0030] 进一步，所述的步骤2)为:取Fmoc-〇rn(Boc)-〇H和HOBt，加 DMF于0°C ±5°C下冷却， 搅拌溶解，加 DIC活化;将活化后的氨基酸加入步骤1)所得的树脂中30°C±5°C通氮气搅拌 反应至茚三酮检测法检测树脂颗粒为无色透明时，抽干反应液，用DMF洗涤，用哌啶/DMF脱 Fmoc保护，再依次用DMF、DCM洗涤，抽干。
[0031] 进一步，步骤5)中所述的裂解试剂是按：三氟乙酸：三异丙基硅烷：H20 = 95 % : 2.5 % : 2.5 %的体积比配制而成;所述的裂解试剂的用量为每克树脂用6~10ml裂解试剂； 所述的裂解反应为在25°C±5°C下裂解反应1~3h，优选2h。
[0032]进一步，步骤6)中用反相高效液相色谱法纯化分离时，采用梯度洗脱，以乙腈为流 动相4,0.05%1?4/出0为流动相8，检测波长为22011111，15%流动相4保持101^11，在101^11到 50min内流动相A变为45%，收集33~39min组分。
[0033]采用本发明的方法制得的醋酸阿托西班杂质C的纯度达99.9%，可作为醋酸阿托 西班合成过程中产生的工艺杂质或者降解杂质的可靠对照，可用于醋酸阿托西班合成中的 杂质定性和定量的分析，为进一步控制醋酸阿托西班的质量开通了道路。
[0034]本发明所述的醋酸阿托西班杂质D的制备方法包括如下步骤：
[0035] 1)以Fmoc-Gly-Rink Amide AM树脂为起始物料，溶胀后脱除Fmoc保护，得到Gly- Rink Amide AM树脂；
[0036] 2)以Gly-Rink Amide AM树脂为载体，以DIC/HOBT为缩合试剂，按照Fmoc/tbu固相 多肽合成的方法在Gly-Rink Amide AM树脂上偶联Fmoc-〇rn(Boc)-〇H;
[0037] 3)再按照上述方法依次偶联?111〇(3-?1'〇-0!1、？1]1〇(3-05^(1'1'1:)-0!1、？1]1〇(3-48口（01:1311)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-〇H、Fmoc-Ile-〇H、Fmoc-D-Tyr(Et)-〇H、Mpa(T;rt)-〇H;
[0038] 4)用碘进行固相环化；
[0039] 5)用裂解试剂进行切割得醋酸阿托西班杂质D粗肽，用乙醚沉淀粗肽；
[0040] 6)用反相高效液相色谱法纯化分离，再经浓缩、冻干后即得所述的醋酸阿托西班 杂质D。
[0041] 进一步，步骤1)中Fmoc-Gly-Rink Amide AM树脂的取代度为0.3~1 · lmmol/g。
[0042] 进一步，所述的步骤2)为:取Fmoc-〇rn (Boc) -OH和HOBt，加 DMF于0 °C ± 5 °C下冷却， 搅拌溶解，加 DIC活化;将活化后的氨基酸加入步骤1)所得的树脂中30°C±5°C通氮气搅拌 反应至茚三酮检测法检测树脂颗粒为无色透明时，抽干反应液，用DMF洗涤，用哌啶/DMF脱 Fmoc保护，再依次用DMF、DCM洗涤，抽干。
[0043] 进一步，步骤5)中所述的裂解试剂是按：三氟乙酸：三异丙基硅烷：H20 = 95 % : 2.5 % : 2.5 %的体积比配制而成;所述的裂解试剂的用量为每克树脂用6~10ml裂解试剂； 所述的裂解反应为在25°C±5°C下裂解反应1~3h，优选2h。
[0044] 进一步，步骤6)中用反相高效液相色谱法纯化分离时，采用梯度洗脱，以乙腈为流 动相4,0.05%1?4/出0为流动相8，检测波长为22011111，15%流动相4保持101^11，在101^11到 50min内流动相A变为45%，收集33~39min组分。
[0045] 采用本发明的方法制得的醋酸阿托西班杂质D的纯度达99.8%，可作为醋酸阿托 西班合成过程中产生的工艺杂质或者降解杂质的可靠对照，可用于醋酸阿托西班合成中的 杂质定性和定量的分析，为进一步控制醋酸阿托西班的质量开通了道路。
[0046] 本发明所述的醋酸阿托西班杂质E的制备方法包括如下步骤：
[0047] 1)以Wang树脂为起始物料，溶胀洗涤后，以DIC/H0BT为缩合试剂，将Fmoc-Gly-OH 的羧基与树脂的羟基以酯键相连，得到Fmoc-Gly-Wang树脂；
[0048] 2)以Fmoc-Gly-Wang树脂为载体，以DIC/H0BT为缩合试剂，按照Fmoc/tbu固相多肽 合成的方法在Fmoc-Gly-Wang树脂上偶联Fmoc-〇rn(Boc)-〇H;
[0049] 3)再按照上述方法依次偶联?111〇(3-?1'〇-〇!1、？111〇(3-〇5^(1'1'1:)-〇!1、？111〇(3-4811(1'1'1:)- OH、Fmoc-Thr(tBu)-〇H、Fmoc-Ile-〇H、Fmoc-D-Tyr(Et)-〇H、Mpa(T;rt)-〇H;
[0050] 4)用碘进行固相环化；
[0051 ] 5)用裂解试剂进行切割得醋酸阿托西班杂质E粗肽，用乙醚沉淀粗肽；
[0052] 6)用反相高效液相色谱法纯化分离，再经浓缩、冻干后即得所述的醋酸阿托西班 杂质E。
[0053] 进一步，步骤1)中所述的Wang树脂的取代度为0.3~1. lmmol/g。
[0054] 进一步，所述的步骤2)为:取Fmoc-Orn (Boc) -OH和HOBt，加 DMF于0 °C ± 5 °C下冷却， 搅拌溶解，加 DIC活化;将活化后的氨基酸加入步骤1)所得的树脂中30°C±5°C通氮气搅拌 反应至茚三酮检测法检测树脂颗粒为无色透明时，抽干反应液，用DMF洗涤，用哌啶/DMF脱 Fmoc保护，再依次用DMF、DCM洗涤，抽干。
[0055] 进一步，步骤5)中所述的裂解试剂是按：三氟乙酸：三异丙基硅烷：H20 = 95 % : 2.5 % : 2.5 %的体积比配制而成;所述的裂解试剂的用量为每克树脂用6~10ml裂解试剂； 所述的裂解反应为在25°C±5°C下裂解反应1~3h，优选2h。
[0056]进一步，步骤6)中用反相高效液相色谱法纯化分离时，采用梯度洗脱，以乙腈为流 动相4,0.05%1?4/出0为流动相8，检测波长为22011111，15%流动相4保持101^11，在101^11到 50min内流动相A变为45%，收集33~39min组分。
[0057]采用本发明的方法制得的醋酸阿托西班杂质E的纯度达99.7%，可作为醋酸阿托 西班合成过程中产生的工艺杂质或者降解杂质的可靠对照，可用于醋酸阿托西班合成中的 杂质定性和定量的分析，为进一步控制醋酸阿托西班的质量开通了道路。
[0058] 本发明还提供所述的醋酸阿托西班杂质的序列检测方法，所述的序列分析方法为 采用MS/MS测序。
[0059] 具体地说，所述的采用MS/MS测序为采用傅里叶变换离子回旋共振质谱分别对杂 质A、杂质B、杂质C、杂质D或杂质E进行一级质谱扫描，得到分子离子峰，然后对准分子离子 峰施加能量裂解，得到该分子离子峰的二级质谱碎片信息，通过分析软件分析确定杂质的 序列结构。
[0060] 更具体地说，所述的杂质A、杂质B、杂质C、杂质D和杂质E的一级质谱分子离子峰分 别为 1010 · 44275、1010 · 43629、994 · 43356、995 · 42536 和995 · 42429。
[0061] 本发明还进一步提供所述的醋酸阿托西班杂质A、杂质B、杂质C、杂质D和/或杂质E 在醋酸阿托西班质量检测中作为杂质对照品的应用。
[0062] 根据本发明的方法对原料药中的杂质进行制备、分析和结构鉴定，可以为杂质的 毒理学研究和阐明不良反应发生机制提供基础，同时也可以为工艺合成实验条件的选择提 供参考，有利于生产过程中药品质量的控制。
[0063] 本发明所涉及到的英文缩写具有以下含义：
[0064] Mpa:疏基丙酸 [0065] Tyr:酪氨酸 [0066] lie:异亮氨酸 [0067] Thr:苏氨酸 [0068] Cys:半胱氨酸 [0069] Asn:天冬酰胺 [0070] Asp:天冬氨酸
[0071] D~Asn:D型-天冬醜胺
[0072] Pro:脯氨酸
[0073] Orn:鸟氨酸
[0074] Gly:甘氨酸
[0075] Trt:三苯甲基
[0076] Otbu:叔丁氧基
[0077] Et:乙基
[0078] Boc:叔丁基
[0079] Fmoc:荷甲氧羰基
[0080] H0BT:1-羟基苯并三氮唑
[0081 ] DIC:二异丙基碳二亚胺
[0082] TFA:三氟乙酸
[0083] TIS:三异丙基硅烷
[0084] DMF:N，N_二甲基甲酰胺
[0085] DCM:二氯甲烷
[0086] Rink Amide AM Resin:氨基甲酰胺树脂
[0087] Wang Resin:王树脂
[0088] 与现有技术相比，本发明具有如下优点：
[0089] 本发明确定了醋酸阿托西班所含的新的杂质A、杂质B、杂质C、杂质D和杂质E并合 成之，对于醋酸阿托西班杂质的相关研究意义重大，是提高醋酸阿托西班药品质量急需的 问题，也是解决醋酸阿托西班合成过程中产生的工艺杂质或者降解杂质的可靠对照。它可 以用于醋酸阿托西班合成中的杂质定性和定量的分析，从而可以提高醋酸阿托西班的质量 标准，有效地保障和控制醋酸阿托西班的质量，对醋酸阿托西班原料药的质量研究以及制 剂研究有重要应用价值，为安全用药提供重要的指导意义。
【附图说明】
[0090] 图1为醋酸阿托西班杂质A的一级质谱分离图；
[0091] 图2为醋酸阿托西班杂质A的质谱测序图；
[0092] 图3为醋酸阿托西班杂质B的一级质谱分离图；
[0093] 图4为醋酸阿托西班杂质B的质谱测序图；
[0094] 图5为醋酸阿托西班杂质C的一级质谱分离图；
[0095] 图6为醋酸阿托西班杂质C的质谱测序图；
[0096] 图7为醋酸阿托西班杂质D的一级质谱分离图；
[0097] 图8为醋酸阿托西班杂质D的质谱测序图；
[0098] 图9为醋酸阿托西班杂质E的一级质谱分离图；
[0099] 图10为醋酸阿托西班杂质E的质谱测序图。
【具体实施方式】
[0100]以下为本发明的【具体实施方式】，所述的实施例是为了进一步描述本发明，而不是 限制本发明。
[0101] 【实施例1】杂质A的制备
[0102] (1)称取醋酸阿托西班成品2g，用80ml高纯水超声溶解，搅拌下加入30%的双氧水 20ml，氧化反应2h，得到杂质A的溶液；
[0103] (2)将氧化后的溶液经过0.45um滤膜过滤，半制备型高效液相色谱仪纯化，所用的 色谱柱为C 18填料，（1〇11111，21111111\25〇111111);每次上样量为1〇1111(0.28)，以乙腈为流动相八， 0.05%了?六/!120为流动相8，检测波长为220腦，15%流动相4保持101^11，在101^11到501^11内 流动相A变为45 %，收集36-39min组分，为杂质A组分，在40°C下浓缩去除乙腈，然后装瓶冻 干，得到杂质A。杂质A用液相色谱法测定其纯度为99.9%。
[0104] 【实施例2】杂质A的制备
[0105] (1)称取醋酸阿托西班成品2g，用80ml高纯水超声溶解，搅拌下加入30%的双氧水 l〇ml，氧化反应lh，得到杂质A的溶液；
[0106] (2)将氧化后的溶液经过0.45um滤膜过滤，半制备型高效液相色谱仪纯化，所用的 色谱柱为C 18填料，（1〇11111，21111111\25〇111111);每次上样量为1〇1111(0.28)，以乙腈为流动相八， 0.05%了?六/!120为流动相8，检测波长为220腦，15%流动相4保持101^11，在101^11到501^11内 流动相A变为45 %，收集36-39min组分，为杂质A组分，在35°C下浓缩去除乙腈，然后装瓶冻 干，得到杂质A。杂质A用液相色谱法测定其纯度为99.8%。
[0107] 【实施例3】杂质A的制备
[0108] (1)称取醋酸阿托西班成品2g，用80ml高纯水超声溶解，搅拌下加入30%的双氧水 30ml，氧化反应3h，得到杂质A的溶液；
[0109] (2)将氧化后的溶液经过0.45um滤膜过滤，半制备型高效液相色谱仪纯化，所用的 色谱柱为C 18填料，（1〇11111，21111111\25〇111111);每次上样量为1〇1111(0.28)，以乙腈为流动相八， 0.05%了?六/!120为流动相8，检测波长为220腦，15%流动相4保持101^11，在101^11到501^11内 流动相A变为45 %，收集36-39min组分，为杂质A组分，在45°C下浓缩去除乙腈，然后装瓶冻 干，得到杂质A。杂质A用液相色谱法测定其纯度为99.8%。
[0110] 【实施例4】杂质A的制备
[0111] (1)称取醋酸阿托西班成品2g，用80ml高纯水超声溶解，搅拌下加入30 %的双氧水 25ml，氧化反应2.5h，得到杂质A的溶液；
[0112] (2)将氧化后的溶液经过0.45um滤膜过滤，半制备型高效液相色谱仪纯化，所用的 色谱柱为C 18填料，（1〇11111，21111111\25〇111111);每次上样量为1〇1111(0.28)，以乙腈为流动相八， 0.05%了?六/!120为流动相8，检测波长为220腦，15%流动相4保持101^11，在101^11到501^11内 流动相A变为45 %，收集36-39min组分，为杂质A组分，在38°C下浓缩去除乙腈，然后装瓶冻 干，得到杂质A。杂质A用液相色谱法测定其纯度为99.7%。
[0113] 【实施例5】杂质B的制备
[0114] (1)称取醋酸阿托西班成品2g，用80ml高纯水超声溶解，搅拌下加入30%的双氧水 20ml，氧化反应2h，得到杂质B的溶液；
[0115] (2)将氧化后的溶液经过0.45um滤膜过滤，半制备型高效液相色谱仪纯化，所用的 色谱柱为C 18填料，（1〇11111，21111111\25〇111111);每次上样量为1〇1111(0.28)，以乙腈为流动相八， 0.05%了?六/!120为流动相8，检测波长为220腦，15%流动相4保持101^11，在101^11到501^11内 流动相A变为45 %，收集40-43min组分，为杂质B组分，在40°C下浓缩去除乙腈，然后装瓶冻 干，得到杂质B。杂质B用液相色谱法测定其纯度为99.9%。
[0116] 【实施例6】杂质B的制备
[0117] (1)称取醋酸阿托西班成品2g，用80ml高纯水超声溶解，搅拌下加入30 %的双氧水 l〇ml，氧化反应lh，得到杂质B的溶液；
[0118] (2)将氧化后的溶液经过0.45um滤膜过滤，半制备型高效液相色谱仪纯化，所用的 色谱柱为C18填料，（1〇11111，21111111\25〇111111);每次上样量为1〇1111(0.28)，以乙腈为流动相八， 0.05%了?六/!120为流动相8，检测波长为220腦，15%流动相4保持101^11，在101^11到501^11内 流动相A变为45 %，收集40-43min组分，为杂质B组分，在35°C下浓缩去除乙腈，然后装瓶冻 干，得到杂质B。杂质B用液相色谱法测定其纯度为99.8%。
[0119] 【实施例7】杂质B的制备
[0120] (1)称取醋酸阿托西班成品2g，用80ml高纯水超声溶解，搅拌下加入30%的双氧水 30ml，氧化反应3h，得到杂质B的溶液；
[0121] (2)将氧化后的溶液经过0.45um滤膜过滤，半制备型高效液相色谱仪纯化，所用的 色谱柱为C18填料，（1〇11111，21111111\25〇111111);每次上样量为1〇1111(0.28)，以乙腈为流动相八， 0.05%了?六/!120为流动相8，检测波长为220腦，15%流动相4保持101^11，在101^11到501^11内 流动相A变为45 %，收集40-43min组分，为杂质B组分，在45°C下浓缩去除乙腈，然后装瓶冻 干，得到杂质B。杂质B用液相色谱法测定其纯度为99.7%。
[0122] 【实施例8】杂质B的制备
[0123] (1)称取醋酸阿托西班成品2g，用80ml高纯水超声溶解，搅拌下加入30%的双氧水 22ml，氧化反应2.5h，得到杂质A的溶液；
[0124] (2)将氧化后的溶液经过0.45um滤膜过滤，半制备型高效液相色谱仪纯化，所用的 色谱柱为C18填料，（1〇11111，21111111\25〇111111);每次上样量为1〇1111(0.28)，以乙腈为流动相八， 0.05%了?六/!120为流动相8，检测波长为220腦，15%流动相4保持101^11，在101^11到501^11内 流动相A变为45 %，收集40-43min组分，为杂质B组分，在38°C下浓缩去除乙腈，然后装瓶冻 干，得到杂质B。杂质B用液相色谱法测定其纯度为99.8%。
[0125] 【实施例9】杂质C的制备
[0126] (1)称取Fmoc-Gly-Rink Amide AM树脂2g(取代值为0.715mmol/g)，加入多肽合成 反应柱中，加 DMF 20ml溶胀30min，抽干。用DMF20ml洗涤树脂l-2min，抽干。反复洗涤两次， 用DCM 20ml洗涤树脂l-2min，抽干。反复洗涤两次。用20 %哌啶/DMF 20ml脱Fmoc两次，每次 lOmin。用DMF 15ml洗涤树脂l-2min，抽干。反复洗涤四次。用DCM 20ml洗涤树脂l-2min，抽 干。反复洗涤两次。取少量树脂用茚三酮检测法检测，树脂应显阳性，即树脂显黄色或红褐 色。
[0127] (2)称取Fmoc-〇rn(Boc)-〇H( 1 · 3g，2·86mmol)、H0Bt(0.43g，3· 15mmol)于干燥反应 瓶中，加 DMF 20ml置于0°C ± 5 °C中冷却，搅拌溶解。加 DIC(0.66ml，4.29mmo 1)活化5min以 上。将活化后的氨基酸加入上一步树脂中30°C±5°C通氮气搅拌反应约2h。取约30颗左右树 月旨，用茚三酮检测法检测偶联效果，如树脂颗粒为无色透明。抽干反应液。用DMF20ml洗涤树 月旨l-2min，反复洗涤三次。用20 %哌啶/DMF20ml脱Fmoc两次，每次lOmin。用DMF20ml洗涤树 脂1 _2min，抽干。反复洗涤四次。用DCM20ml洗涤树脂1 _2min，抽干。反复洗涤两次。
[0128] (3)按照上述方法依次偶联Fmoc-Pro_0H(0 · 96g，2 · 86mmol)、Fmoc_Cys(Trt)-〇H (1·68g，2·86mmol)、Fmoc-D-Asn(Trt)-〇H(1·71g，2·86mmol)、Fmoc-Thr(tBu)-〇H(1·14g， 2·86mmol)、Fmoc_Ile-〇H(1·Olg，2·86mmol)、Fmoc-D-Tyr(Et)-〇H(1·23g，2·86mmol)、Mpa (Trt)-OH(1.00g,2.86mmol)；
[0129] (4)称取碘（1 · 82g，7 · 15mmo 1)于干燥反应瓶中，加 DMF 20ml置于0°C ± 5°C中冷却， 搅拌溶解30min。将上述溶液加入上一步树脂中20°C±5°C反应l_1.5h。抽干反应液。用 DMF20ml洗涤树脂2-5min，抽干，反复洗涤六次以上，至洗出液为淡黄色。用DCM20ml洗涤树 脂2-5min，抽干，反复洗涤三次以上。将肽树脂置室温真空干燥10h以上，得3.21g。
[0130] (5)称取上述干燥的阿托西班肽树脂加入于反应瓶中。按照比例配制裂解试剂 261111〇?4 :1'13:!120 = 95:2.5:2.5，18树脂用81111裂解试剂），置01€±5°(：环境冷却，加入反应 瓶中。开启搅拌，低速搅动树脂，25°C±5°C裂解反应2h。反应结束后，过滤，滤液加入到 260ml的冰乙醚中，5°C±5°C沉降1~2h，析出沉淀粗肽。0°C_4°C环境下，低速离心5-10min， 分离出沉淀粗肽，用氮气吹走沉淀粗肽中残余乙醚，置于真空干燥箱中，室温干燥l〇h以上， 得粗肽0.74g，粗肽收率为52 %。
[0131] (6)将粗肽0.74g，用纯化水25ml溶解，经0.45μπι滤膜过滤，分三次进样，进行高效 液相色谱纯化。纯化过程采用梯度洗脱，以乙腈为流动相A，0.05 % TFA/H20为流动相Β，检测 波长为22〇11111，15%流动相4保持1〇111；[11，在10111；[11到50111；[11内流动相4变为45%，收集33-39111；[11 组分。
[0132] (7)将收集液40°C下浓缩去除乙腈，再转入20ml西林瓶中冻干得杂质C。杂质C用液 相色谱法测定其纯度为99.9 %。
[0133] 【实施例10】杂质C的制备
[0134] (1)称取Fmoc-Gly-Rink Amide AM树脂2g(取代值为0.3mmol/g)，加入多肽合成反 应柱中，加 DMF 20ml溶胀30min，抽干。依次用DMF、DCM反复洗涤树脂，抽干。用哌啶/DMF脱 Fmoc两次，每次lOmin。用DMF、DCM反复洗涤树脂，抽干。取少量树脂用茚三酮检测法检测，树 脂应显阳性，即树脂显黄色或红褐色，得到Gly-Rink Amide AM树脂。
[0135] (2)称取卩111〇(3-01'11(13〇(3)-0!1(2.008,4.41]1〇1)和!10131:(0.658,4.841]1〇1)于干燥反应 瓶中，加 DMF20ml于0°C±5°C下冷却，搅拌溶解，加0比(1.〇1111，6.6_〇1)活化51^11以上;将活 化后的氨基酸加入步骤1)所得的树脂中30°C±5°C通氮气搅拌反应至茚三酮检测法检测树 脂颗粒为无色透明时，抽干反应液，用DMF反复洗涤树脂，用哌啶/DMF脱Fmoc两次，每次 10min。用DMF、DCM反复洗涤树脂。
[0136] (3)再按照上述方法依次偶联？111〇(3-?1'〇-0!1、？111〇(3-078(1'1'1:)-0!1、？111〇(3-0-八811 (Trt)-〇H、Fmoc-Thr(tBu)-〇H、Fmoc-Ile-〇H、Fmoc-D-Ty;r(Et)-〇H、Mpa(T;rt)-〇H;
[0137] (4)称取碘（1 · 82g，7 · 15mmo 1)于干燥反应瓶中，加 DMF 20ml置于0°C ± 5°C中冷却， 搅拌溶解30min。将上述溶液加入上一步树脂中20°C±5°C反应l_1.5h。抽干反应液。用 DMF20ml洗涤树脂2-5min，抽干，反复洗涤六次以上，至洗出液为淡黄色。用DCM20ml洗涤树 脂2-5min，抽干，反复洗涤三次以上。将肽树脂置室温真空干燥10h以上，得3.21g。
[0138] (5)称取上述干燥的树脂加入于反应瓶中。按照比例配制裂解试剂26ml(TFA:TIS: H20 = 95: 2.5: 2.5，1 g树脂用6m 1裂解试剂），置0 °C ± 5 °C环境冷却，加入反应瓶中。开启搅 拌，低速搅动树脂，25°C ± 5°C裂解反应lh。乙醚沉淀得粗肽。
[0139] (6)用反相高效液相色谱法采用梯度洗脱，以乙腈为流动相A，0.05%TFA/H20为流 动相B，检测波长为220nm，15%流动相A保持lOmin，在lOmin到50min内流动相A变为45%，收 集33~39min组分，再经浓缩、冻干后即得所述的醋酸阿托西班杂质C。杂质C用液相色谱法 测定其纯度为99.8%。
[0140] 【实施例11】杂质C的制备
[0141] (1)称取Fmoc-Gly-Rink Amide AM树脂2g(取代值为1 .Ommol/g)，加入多肽合成反 应柱中，加 DMF 20ml溶胀30min，抽干。依次用DMF、DCM反复洗涤树脂，抽干。用哌啶/DMF脱 Fmoc两次，每次10min。用DMF、DCM反复洗涤树脂，抽干。取少量树脂用茚三酮检测法检测，树 脂应显阳性，即树脂显黄色或红褐色，得到Gly-Rink Amide AM树脂。
[0142] (2)称取卩111〇(3-01'11(13〇(3)-0!1(2.008,4.41]1〇1)和!10131:(0.658,4.841]1〇1)于干燥反应 瓶中，加 DMF20ml于0°C±5°C下冷却，搅拌溶解，加0比(1.〇1111，6.6_〇1)活化51^11以上;将活 化后的氨基酸加入步骤1)所得的树脂中30°C±5°C通氮气搅拌反应至茚三酮检测法检测树 脂颗粒为无色透明时，抽干反应液，用DMF反复洗涤树脂，用哌啶/DMF脱Fmoc两次，每次 10min。用DMF、DCM反复洗涤树脂。
[0143] (3)再按照上述方法依次偶联卩111〇(3-?1'〇-0!1、卩111〇(3-〇5^(1'1'1:)-0!1、卩111〇(3-0-八811 (Trt)-〇H、Fmoc-Thr(tBu)-〇H、Fmoc-Ile-〇H、Fmoc-D-Ty;r(Et)-〇H、Mpa(T;rt)-〇H;
[0144] (4)称取碘（1.82g，7.15mmol)于干燥反应瓶中，加 DMF20ml置于0°C±5°C中冷却， 搅拌溶解30min。将上述溶液加入上一步树脂中20°C±5°C反应l_1.5h。抽干反应液。用 DMF20ml洗涤树脂2-5min，抽干，反复洗涤六次以上，至洗出液为淡黄色。用DCM20ml洗涤树 脂2-5min，抽干，反复洗涤三次以上。将肽树脂置室温真空干燥10h以上，得3.21g。
[0145] (5)称取上述干燥的树脂加入于反应瓶中。按照比例配制裂解试剂26ml(TFA:TIS: H20 = 95:2.5: 2.5，lg树脂用10ml裂解试剂），置0°C ± 5 °C环境冷却，加入反应瓶中。开启搅 拌，低速搅动树脂，25 °C ± 5 °C裂解反应3h。乙醚沉淀得粗肽。
[0146] (6)用反相高效液相色谱法采用梯度洗脱，以乙腈为流动相A，0.05 % TFA/H20为流 动相B，检测波长为220nm，15%流动相A保持10min，在10min到50min内流动相A变为45%，收 集33~39min组分，再经浓缩、冻干后即得所述的醋酸阿托西班杂质C。杂质C用液相色谱法 测定其纯度为99.9%。
[0147] 【实施例12】醋酸阿托西班杂质D的制备
[0148] (1)称取Fmoc-Gly-Rink Amide AM树脂2g(取代值为0.715mmol/g)，加入多肽合成 反应柱中，加 DMF 20ml溶胀30min，抽干。用DMF20ml洗涤树脂l-2min，抽干。反复洗涤两次， 用DCM 20ml洗涤树脂l-2min，抽干。反复洗涤两次。用20%哌啶/DMF 20ml脱Fmoc两次，每次 10min。用DMF 15ml洗涤树脂l-2min，抽干。反复洗涤四次。用DCM 20ml洗涤树脂l-2min，抽 干。反复洗涤两次。取少量树脂用茚三酮检测法检测，树脂应显阳性，即树脂显黄色或红褐 色。
[0149] (2)称取Fmoc-〇rn(Boc)-〇H( 1 · 3g，2·86mmol)、H0Bt(0.43g，3· 15mmol)于干燥反应 瓶中，加 DMF 20ml置于0°C ± 5 °C中冷却，搅拌溶解。加 DIC(0.66ml，4.29mmo 1)活化5min以 上。将活化后的氨基酸加入上一步树脂中30°C±5°C通氮气搅拌反应约2h。取约30颗左右树 月旨，用茚三酮检测法检测偶联效果，如树脂颗粒为无色透明。抽干反应液。用DMF20ml洗涤树 月旨l-2min，反复洗涤三次。用20 %哌啶/DMF20ml脱Fmoc两次，每次10min。用DMF20ml洗涤树 脂1 -2min，抽干。反复洗涤四次。用DCM20ml洗涤树脂1 _2min，抽干。反复洗涤两次。
[0150] (3)按照上述方法依次偶联Fmoc-Pro_0H(0 · 96g，2 · 86mmol)、Fmoc_Cys(Trt)-〇H (1·68g，2·86mmol)、Fmoc_Asp(Otbu)-〇H(1·18g，2·86mmol)、Fmoc-Thr(tBu)-〇H(1·14g， 2·86mmol)、Fmoc_Ile-〇H(1·Olg，2·86mmol)、Fmoc-D-Tyr(Et)-〇H(1·23g，2·86mmol)、Mpa (Trt)-OH(1.00g,2.86mmol)
[0151] (4)称取碘（1.828,7.15臟〇1)于干燥反应瓶中，加01^201111置于0 1€±5°(：中冷却， 搅拌溶解30min。将上述溶液加入上一步树脂中20°C±5°C反应l_1.5h。抽干反应液。用 DMF20ml洗涤树脂2-5min，抽干，反复洗涤六次以上，至洗出液为淡黄色。用DCM20ml洗涤树 脂2-5min，抽干，反复洗涤三次以上。将肽树脂置室温真空干燥1 Oh以上，得3.09g。
[0152] (5)称取上述干燥的肽树脂3.09g加入于反应瓶中。按照比例配制裂解试剂24ml (丁卩厶:1'13:!120 = 95:2.5:2.5，18树脂用81111裂解试剂），置01€±5°(：环境冷却，加入反应瓶 中。开启搅拌，低速搅动树脂，25°C ± 5°C裂解反应2h。反应结束后，过滤，滤液加入到240ml 的冰乙醚中，5 °C ± 5 °C沉降1~2h，析出沉淀粗肽。0 °C-4°C环境下，低速离心5-1 Omin，分离 出沉淀粗肽，用氮气吹走沉淀粗肽中残余乙醚，置于真空干燥箱中，室温干燥l〇h以上，得粗 肽0.68 8，粗肽收率为47.9%。
[0153] (6)将粗肽0.68g，用纯化水22ml溶解，经0.45μπι滤膜过滤，分三次进样，进行反相 高效液相色谱纯化。纯化过程采用梯度洗脱，以乙腈为流动相A，0.05 % TFA/H20为流动相Β， 检测波长为220nm，15%流动相A保持lOmin，在lOmin到50min内流动相A变为45%，收集33-39min组分。
[0154] (7)将收集液40°C下浓缩去除乙腈，再转入20ml西林瓶中冻干得杂质D。杂质D用液 相色谱法测定其纯度为99.8 %。
[0155] 【实施例13】醋酸阿托西班杂质D的制备
[0156] (1)称取Fmoc-Gly-Rink Amide AM树脂2g(取代值为0.3mmol/g)，加入多肽合成反 应柱中，加 DMF20ml溶胀30min，抽干。依次用DMF、DCM反复洗涤树脂，抽干。用哌啶/DMF脱 Fmoc两次，每次10min。用DMF、DCM反复洗涤树脂，抽干。取少量树脂用茚三酮检测法检测，树 脂应显阳性，即树脂显黄色或红褐色，得到Gly-Rink Amide AM树脂。
[0157] (2)称取 Fmoc-〇rn (Boc) -OH (1 · 3g，2 · 86mo 1)和HOBt (0 · 43g，3 · 15mo 1)于干燥反应 瓶中，加 DMF20ml于0°C±5°C下冷却，搅拌溶解，加01以0.661111，4.29111111〇1)活化51^11以上;将 活化后的氨基酸加入步骤1)所得的树脂中30°C±5°C通氮气搅拌反应至茚三酮检测法检测 树脂颗粒为无色透明时，抽干反应液，用DMF反复洗涤树脂，用哌啶/ DMF脱Fmo c两次，每次 10min。用DMF、DCM反复洗涤树脂。
[0158] (3)再按照上述方法依次偶联?111〇(3-?1'〇-0!1、？1]1〇(3-078(1'1'1:)-0!1、？1]1〇(3-48。(01:1311)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-〇H、Fmoc-Ile-〇H、Fmoc-D-Tyr(Et)-〇H、Mpa(T;rt)-〇H;
[0159] (4)称取碘（1 · 82g，7 · 15mmo 1)于干燥反应瓶中，加 DMF 20ml置于0°C ± 5°C中冷却， 搅拌溶解30min。将上述溶液加入上一步树脂中20°C±5°C反应l_1.5h。抽干反应液。用 DMF20ml洗涤树脂2-5min，抽干，反复洗涤六次以上，至洗出液为淡黄色。用DCM20ml洗涤树 脂2-5min，抽干，反复洗涤三次以上。将肽树脂置室温真空干燥10h以上，得3.21g。
[0160] (5)称取上述干燥的树脂加入于反应瓶中。按照比例配制裂解试剂24ml(TFA:TIS: 出0 = 95:2.5:2.5,4树脂用61111裂解试剂），置01€±5°(：环境冷却，加入反应瓶中。开启搅 拌，低速搅动树脂，25°C ± 5°C裂解反应lh。乙醚沉淀得粗肽。
[0161] (6)用反相高效液相色谱法采用梯度洗脱，以乙腈为流动相A，0.05 % TFA/H20为流 动相B，检测波长为220nm，15%流动相A保持lOmin，在lOmin到50min内流动相A变为45%，收 集33~39min组分，再经浓缩、冻干后即得所述的醋酸阿托西班杂质D。杂质D用液相色谱法 测定其纯度为99.7%。
[0162] 【实施例14】醋酸阿托西班杂质D的制备
[0163] (1)称取Fmoc-Gly-Rink Amide AM树脂2g(取代值为1 · lmmol/g)，加入多肽合成反 应柱中，加 DMF 20ml溶胀30min，抽干。依次用DMF、DCM反复洗涤树脂，抽干。用哌啶/DMF脱 Fmoc两次，每次lOmin。用DMF、DCM反复洗涤树脂，抽干。取少量树脂用茚三酮检测法检测，树 脂应显阳性，即树脂显黄色或红褐色，得到Gly-Rink Amide AM树脂。
[0164] (2)称取 Fmoc-〇rn (Boc) -OH (1 · 3g，2 · 86mo 1)和HOBt (0 · 43g，3 · 15mo 1)于干燥反应 瓶中，加 DMF20ml于0°C±5°C下冷却，搅拌溶解，加01以0.661111，4.29111111〇1)活化51^11以上;将 活化后的氨基酸加入步骤1)所得的树脂中30°C±5°C通氮气搅拌反应至茚三酮检测法检测 树脂颗粒为无色透明时，抽干反应液，用DMF反复洗涤树脂，用哌啶/ DMF脱Fmo c两次，每次 10min。用DMF、DCM反复洗涤树脂。
[0165] (3)再按照上述方法依次偶联?111〇(3-?1'〇-0!1、？1]1〇(3-05^(1'1'1:)-0!1、？1]1〇(3-48口(01:1311)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-〇H、Fmoc-Ile-〇H、Fmoc-D-Tyr(Et)-〇H、Mpa(T;rt)-〇H;
[0166] (4)称取碘（1.82g，7.15mmol)于干燥反应瓶中，加 DMF20ml置于0°C±5°C中冷却， 搅拌溶解30min。将上述溶液加入上一步树脂中20°C±5°C反应l_1.5h。抽干反应液。用 DMF20ml洗涤树脂2-5min，抽干，反复洗涤六次以上，至洗出液为淡黄色。用DCM20ml洗涤树 脂2-5min，抽干，反复洗涤三次以上。将肽树脂置室温真空干燥10h以上，得3.21g。
[0167] (5)称取上述干燥的树脂加入于反应瓶中。按照比例配制裂解试剂24ml(TFA:TIS: H20 = 95:2.5: 2.5，lg树脂用10ml裂解试剂），置0°C ± 5 °C环境冷却，加入反应瓶中。开启搅 拌，低速搅动树脂，25 °C ± 5 °C裂解反应3h。乙醚沉淀得粗肽。
[0168] (6)用反相高效液相色谱法采用梯度洗脱，以乙腈为流动相A，0.05 % TFA/H20为流 动相B，检测波长为220nm，15%流动相A保持10min，在10min到50min内流动相A变为45%，收 集33~39min组分，再经浓缩、冻干后即得所述的醋酸阿托西班杂质D。杂质D用液相色谱法 测定其纯度为99.7%。
[0169] 【实施例15】醋酸阿托西班杂质E的制备
[0170] (1)称取Wang树脂2g(取代值为1 · lmmo 1 /g)加入多肽合成反应柱中，加 DMF 20ml溶 胀30min，抽干。用DMF20ml洗涤树脂l-2min，抽干。反复洗涤两次，用DCM 20ml洗涤树脂1-2min，抽干。反复洗潘两次。称取Fmoc-Gly-〇H(0 · 65g，2 · 2mmol)、H0Bt(0 · 36g，2 · 64mmol)、 DMAP(0.05g，0.44mmol)于干燥反应瓶中，加 DMF 20ml置于0°C ± 5°C中冷却，搅拌溶解，加 DIC(0.5ml，3.3mmol)活化5min以上。将活化后的氨基酸加入上述树脂中30°C±5°C通氮气 搅拌反应约2h。用DMF20ml洗涤4次。加入乙酸酐封闭反应2h。抽干反应液，用DMF20ml洗涤树 月旨l-2min，反复洗涤三次。用20 %哌啶/DMF20ml脱Fmoc两次，每次10min。用DMF20ml洗涤树 脂1 -2mi，抽干，反复洗涤四次。用DCM20ml洗涤树脂1 _2min，抽干，反复洗涤两次。
[0171 ] (2)称取卩111〇(3-〇1'11(13〇(3)-〇!1(2.0〇8,4· 4mmo1)、H0Bt(0 · 65g，4 · 84mmol)于干燥反应 瓶中，加 DMF 20ml置于0 °C ± 5 °C中冷却，搅拌溶解。加 DIC(1.0ml，6.6mmo 1)活化5min以上。 将活化后的氨基酸加入上一步树脂中30°C±5°C通氮气搅拌反应约2h。取约30颗左右树脂， 用茚三酮检测法检测偶联效果，树脂颗粒应为无色透明。抽干反应液，用DMF20ml洗涤树脂 l-2min，反复洗涤三次。用20 %哌啶/DMF20ml脱Fmoc两次，每次lOmin。用DMF20ml洗涤树脂 1 _2min，抽干，反复洗涤四次。用DCM20ml洗涤树脂1 _2min，抽干，反复洗涤两次。
[0172] (3)按照上述方法依次偶联Fmoc-Pro_0H( 1 · 48g，4 · 4mmol)、Fmoc_Cys(Trt)-〇H (2·58g，4·4mmo1)、Fmoc-Asn(Trt)-〇H(2·63g，4·4mmo1)、Fmoc-Thr(tBu)-〇H(1·75g， 4.4mmol)、Fmoc_Ile_0H(1·55g，4·4mmol)、Fmoc-D-Tyr(Et)-〇H(1·90g，4·4mmol)、Mpa (Trt)-OH(l.53g,4.4mmol)
[0173] (4)称取碘(2.8(^，11臟〇1)于干燥反应瓶中，加01^301111置于01€±5°(：中冷却，搅 拌溶解30min。将上述溶液加入上一步树脂中20°C±5°C反应l_1.5h。抽干反应液。用 DMF20ml洗涤树脂2-5min，抽干，反复洗涤六次以上，至洗出液为淡黄色。用DCM20ml洗涤树 脂2-5min，抽干，反复洗涤三次以上。将肽树脂置室温真空干燥1 Oh以上，得3.36g。
[0174] (5)称取上述干燥的阿托西班肽树脂加入于反应瓶中。按照比例配制裂解试剂 271111〇?4:1'13:!120 = 95:2.5:2.5，18树脂用81111裂解试剂），置01€±5°(：环境冷却，加入反应 瓶中。开启搅拌，低速搅动树脂，25°C±5°C裂解反应2h。反应结束后，过滤，滤液加入到 200ml的冰乙醚中，5°C±5°C沉降1~2h，析出沉淀粗肽。0°C_4°C环境下，低速离心5-10min， 分离出沉淀粗肽，用氮气吹走沉淀粗肽中残余乙醚，置于真空干燥箱中，室温干燥l〇h以上， 得1.26 8，粗肽收率为57.5%。
[0175] (6)将粗肽1.26g，用纯化水40ml溶解，经0.45μπι滤膜过滤，分四次进样，进行高效 液相色谱纯化。纯化过程采用梯度洗脱，以乙腈为流动相A，0.05 % TFA/H20为流动相Β，检测 波长为22〇11111，15%流动相4保持1〇111；[11，在10111；[11到50111；[11内流动相4变为45%，收集33-39111；[11 组分。
[0176] (7)将收集液40°C下浓缩去除乙腈，再转入20ml西林瓶中冻干得杂质E。杂质E用液 相色谱法测定其纯度为99.7%。
[0177] 【实施例16】醋酸阿托西班杂质E的制备
[0178] (1)称取Wang树脂2g(取代值为0 · 3mmo 1 /g)，加入多肽合成反应柱中，加 DMF20ml溶 胀30min，抽干。依次用DMF、DCM反复洗涤树脂，抽干。称取Fmoc-Gly-〇H(0.65g，2.2mmo 1)、 HOBt (0 · 36g，2 · 64mmo 1)、DMAP(0 · 05g，0 · 44mmo 1)于干燥反应瓶中，加 DMF 20ml置于0°C ± 5 °C中冷却，搅拌溶解，加 DIC(0.5ml，3.3mmol)活化5min以上。将活化后的氨基酸加入上述树 脂中30 °C ± 5°C通氮气搅拌反应约2h。用DMF20ml洗涤4次。加入乙酸酐封闭反应2h。抽干反 应液，用DMF20ml洗涤树脂l-2min，反复洗涤三次。用20 %哌啶/DMF20ml脱Fmoc两次，每次 10min。用DMF20ml洗涤树脂l-2min，抽干，反复洗涤四次。用DCM20ml洗涤树脂l-2min，抽干， 反复洗涤两次。
[0179] (2)称取 Fmoc-〇rn (Boc) -OH (1 · 3g，2 · 86mo 1)和HOBt (0 · 43g，3 · 15mo 1)于干燥反应 瓶中，加 DMF20ml于0°C±5°C下冷却，搅拌溶解，加0比(1.〇1111，6.6_〇1)活化51^11以上;将活 化后的氨基酸加入步骤1)所得的树脂中30°C±5°C通氮气搅拌反应至茚三酮检测法检测树 脂颗粒为无色透明时，抽干反应液，用DMF反复洗涤树脂，用哌啶/DMF脱Fmoc两次，每次 10min。用DMF、DCM反复洗涤树脂。
[0180] (3)再按照上述方法依次偶联?111〇(3-?1'〇-0!1、？1]1〇(3-05^(1'1'1:)-0!1、？1]1〇(3-48口（01:1311)- OH、Fmoc-Thr(tBu)-〇H、Fmoc-Ile-〇H、Fmoc-D-Tyr(Et)-〇H、Mpa(T;rt)-〇H;
[0181] (4)称取碘(2.8(^，11臟〇1)于干燥反应瓶中，加01^301111置于01€±5°(：中冷却，搅 拌溶解30min。将上述溶液加入上一步树脂中20°C±5°C反应l_1.5h。抽干反应液。用 DMF20ml洗涤树脂2-5min，抽干，反复洗涤六次以上，至洗出液为淡黄色。用DCM20ml洗涤树 脂2-5min，抽干，反复洗涤三次以上。将肽树脂置室温真空干燥10h以上，得3.21g。
[0182] (5)称取上述干燥的树脂加入于反应瓶中。按照比例配制裂解试剂24ml(TFA:TIS: 出0 = 95:2.5:2.5,4树脂用61111裂解试剂），置01€±5°(：环境冷却，加入反应瓶中。开启搅 拌，低速搅动树脂，25°C ± 5°C裂解反应lh。乙醚沉淀得粗肽。
[0183] (6)用反相高效液相色谱法采用梯度洗脱，以乙腈为流动相A，0.05% TFA/H20为流 动相B，检测波长为220nm，15%流动相A保持lOmin，在lOmin到50min内流动相A变为45%，收 集33~39min组分，再经浓缩、冻干后即得所述的醋酸阿托西班杂质E。杂质E用液相色谱法 测定其纯度为99.6%。
[0184] 【实施例17】醋酸阿托西班杂质E的制备
[0185] (1)称取Wang树脂2g(取代值为1 · lmmol/g)，加入多肽合成反应柱中，加 DMF20ml溶 胀30min，抽干。依次用DMF、DCM反复洗涤树脂，抽干。称取Fmoc-Gly-〇H(0.65g，2.2mmo 1)、 HOBt (0 · 36g，2 · 64mmo 1)、DMAP(0 · 05g，0 · 44mmo 1)于干燥反应瓶中，加 DMF 20ml置于0°C ± 5 °C中冷却，搅拌溶解，加 DIC(0.5ml，3.3mmol)活化5min以上。将活化后的氨基酸加入上述树 脂中30 °C ± 5°C通氮气搅拌反应约2h。用DMF20ml洗涤4次。加入乙酸酐封闭反应2h。抽干反 应液，用DMF20ml洗涤树脂l-2min，反复洗涤三次。用20 %哌啶/DMF20ml脱Fmoc两次，每次 10min。用DMF20ml洗涤树脂l-2mi，抽干，反复洗涤四次。用DCM20ml洗涤树脂l-2min，抽干， 反复洗涤两次。
[0186] (2)称取 Fmoc-〇rn (Boc) -OH (1 · 3g，2 · 86mo 1)和HOBt (0 · 43g，3 · 15mo 1)于干燥反应 瓶中，加 DMF20ml于0°C±5°C下冷却，搅拌溶解，加0比(1.〇1111，6.6_〇1)活化51^11以上;将活 化后的氨基酸加入步骤1)所得的树脂中30°C±5°C通氮气搅拌反应至茚三酮检测法检测树 脂颗粒为无色透明时，抽干反应液，用DMF反复洗涤树脂，用哌啶/DMF脱Fmoc两次，每次 10min。用DMF、DCM反复洗涤树脂。
[0187] (3)再按照上述方法依次偶联?111〇(3-?1'〇-0!1、？1]1〇(3-05^(1'1'1:)-0!1、？1]1〇(3-48口（01:1311)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-〇H、Fmoc-Ile-〇H、Fmoc-D-Tyr(Et)-〇H、Mpa(T;rt)-〇H;
[0188] (4)称取碘(2.8(^，11臟〇1)于干燥反应瓶中，加01^301111置于01€±5°(：中冷却，搅 拌溶解30min。将上述溶液加入上一步树脂中20°C±5°C反应l_1.5h。抽干反应液。用 DMF20ml洗涤树脂2-5min，抽干，反复洗涤六次以上，至洗出液为淡黄色。用DCM20ml洗涤树 脂2-5min，抽干，反复洗涤三次以上。将肽树脂置室温真空干燥10h以上，得3.21g。
[0189] (5)称取上述干燥的树脂加入于反应瓶中。按照比例配制裂解试剂24ml(TFA:TIS: H 20 = 95:2.5: 2.5，lg树脂用10ml裂解试剂），置0°C ± 5 °C环境冷却，加入反应瓶中。开启搅 拌，低速搅动树脂，25 °C ± 5 °C裂解反应3h。乙醚沉淀得粗肽。
[0190] (6)用反相高效液相色谱法采用梯度洗脱，以乙腈为流动相A，0.05 % TFA/H20为流 动相B，检测波长为220nm，15%流动相A保持10min，在10min到50min内流动相A变为45%，收 集33~39min组分，再经浓缩、冻干后即得所述的醋酸阿托西班杂质E。杂质E用液相色谱法 测定其纯度为99.7%。
[0191]【实施例18】杂质的序列分析
[0192] (1)分别称取冻干后的杂质A、杂质B、杂质C、杂质D和杂质E0. lmg，加高纯水10ml， 振摇溶解，制成浓度为〇. 〇lmg/ml的溶液，经过0.22um滤头过滤后进样。
[0193] (2)采用傅里叶变换离子回旋共振质谱(Bruker Daltonic，Solarix，9.4T)，对杂 质A、杂质B、杂质C、杂质D和杂质E进行一级质谱扫描，扫描条件为:源类型:ESI;干气体流 速:4L/min;干气体温度：180°C ;喷雾器压力：1. Obar;极性:正极;毛细管电压:4KV;锥孔电 压:-500V，分别得到的杂质A、杂质B、杂质C、杂质D和杂质E的一级质谱准分子离子峰见表1。 [0194]表1
[0196] (3)分别对杂质 A，m/zl010.44275、杂质 B，m/zl010.43629、杂质 C，m/z994.43356、 杂质D，m/z995.42536、杂质E，m/z995.42429进行隔离，施加能量碎裂，得到各杂质的碎片信 息，通过分析软件分析相应的杂质结构，见表2。
[0197] 表2
[0199] 【试验例1】裂解试剂的选择
[0200] 肽链组装完毕后需要用强酸将肽链从树脂上释放出来，在切割肽的同时侧链保护 基团也会被相应的脱除，这时需要捕获剂来捕获侧链保护基团形成的正碳离子等活性离 子，以避免其再次与多肽氨基酸残基的活性侧链基团结合生成副产物。
[0201] 1、不同的裂解试剂对杂质C粗肽收率和纯度的影响
[0202] 本试验例以取代值为0.715mmol/g的Fmoc-Gly-Rink Amide AM树脂为起始物料， 按照实施例9的方法逐步偶联得到醋酸阿托西班杂质C肽树脂，再选择不同的裂解试剂裂解 得到醋酸阿托西班杂质C粗肽来对比试验，以杂质C粗肽收率和纯度为考察标准，评价不同 的裂解试剂对反应的影响(表3-1)。
[0203] 表3-1、不同裂解试剂选择实验的结果
[0205] 从上述试验结果可以看出，在其它条件相同的情况下，选择本发明的三氟乙酸:三 异丙基硅烷:水：=95:2.5:2.5裂解试剂获得的醋酸阿托西班杂质C的收率和纯度较高。
[0206] 2、不同的裂解试剂对杂质D粗肽收率和纯度的影响
[0207] 本试验例以取代值为0.715mmol/g的Fmoc-Gly-Rink Amide AM树脂为起始物料， 按照实施例12的方法逐步偶联得到醋酸阿托西班杂质D肽树脂，再选择不同的裂解试剂裂 解得到醋酸阿托西班杂质D粗肽来对比试验，以杂质D粗肽收率和纯度为考察标准，评价不 同的裂解试剂对反应的影响(表3-2)。
[0208] 表3-2、不同裂解试剂选择实验的结果
[0209]
[0210]从上述试验结果可以看出，在其它条件相同的情况下，选择本发明的三氟乙酸:三 异丙基硅烷:水：=95:2.5:2.5裂解试剂获得的醋酸阿托西班杂质D的收率和纯度较高。 [0211] 3、不同的裂解试剂对杂质E粗肽收率和纯度的影响
[0212]本试验例以取代值为1. lmmol/g的Wang树脂为起始物料，按照实施例15的方法逐 步偶联得到醋酸阿托西班杂质E肽树脂，再选择不同的裂解试剂裂解得到醋酸阿托西班杂 质E粗肽来对比试验，以杂质E粗肽收率和纯度为考察标准，评价不同的裂解试剂对反应的 影响(表3-3)。
[0213] 表3-3、不同裂解试剂选择实验的结果
[0214]
[0215]从上述试验结果可以看出，在其它条件相同的情况下，选择本发明的三氟乙酸:三 异丙基硅烷:水：=95:2.5:2.5裂解试剂获得的醋酸阿托西班杂质E的收率和纯度较高。
【主权项】
1. 醋酸阿托西班杂质，其特征在于，所述的醋酸阿托西班杂质为杂质A、杂质B、杂质C、 杂质D或杂质E，其结构序列分别为： 杂质A: c [Mpa (S = O) -D-Tyr(Et)-Il e-Thr-Asn-Cy s ] -Pro-Orn-Gl y_NH2; 杂质 B: c[Mpa-D-Tyr(Et)-Ile-Thr-Asn-Cys(S = 0) ]-Pr〇-〇rn-Gly-NN2; 杂质C: c [Mpa-D-Tyr (Et )-1 le-Thr-D-Asn-Cys ]-Pr〇-〇rn-Gly-NH2; 杂质D: c [Mpa-D-Tyr (Et )-1 le-Thr-Asp-Cys ]-Pr〇-〇rn-Gly-NH2; 杂质E: c [Mpa-D-Tyr(Et)-Ile-Thr-Asn-Cy s ]-Pr〇-〇rn-Gly-〇H 〇2. -种醋酸阿托西班杂质A或杂质B的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括如 下步骤： 1) 将醋酸阿托西班原料药采用双氧水氧化，得到氧化后的溶液； 2) 将氧化后的溶液过滤后采用反相C18柱进行分离纯化，分离纯化时，每次上样量为 IOml，以乙腈为流动相A，0.05 %TFA/H20为流动相B，检测波长为220nm，15 %流动相A保持 IOmin，在IOmin到50min内流动相A变为45 %，分别收集36_39min组分或40_43min组分，再分 别经浓缩、冻干后得到所述的醋酸阿托西班杂质A和杂质B。3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述的醋酸阿托西班原料药 与双氧水的质量体积比为lg:5~15ml，优选Ig: IOml;所述的氧化时间为1~3h，优选2h;所 述的双氧水为质量百分比为30%的双氧水;所述的醋酸阿托西班原料药在采用双氧水氧化 前先用高纯水超声溶解;步骤2)中所述的浓缩为在35~45°C、优选在40°C下浓缩。4. 一种醋酸阿托西班杂质C的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括如下步骤： 1) 以Fmoc-Gly-Rink Amide AM树脂为起始物料，溶胀后脱除Fmoc保护，得到Gly-Rink Amide AM树脂； 2) 以Gly-Rink Amide AM树脂为载体，以DIC/H0BT为缩合试剂，按照Fmoc/tbu固相多肽 合成的方法在Gly-Rink Amide AM树脂上偶联Fmoc-Orn(Boc)-OH; 3) 再按照上述方法依次偶联 Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cy s (Trt)-OH、Fmoc-D-Asn (Trt)-OH、 Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ile_0H、Fmoc-D-Tyr(Et)-〇H、Mpa(Trt)-OH; 4) 用碘进行固相环化； 5) 用裂解试剂进行切割得醋酸阿托西班杂质C粗肽，用乙醚沉淀粗肽； 6) 用反相高效液相色谱法纯化分离，再经浓缩、冻干后即得所述的醋酸阿托西班杂质 Co5. -种醋酸阿托西班杂质D的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括如下步骤： 1) 以Fmoc-Gly-Rink Amide AM树脂为起始物料，溶胀后脱除Fmoc保护，得到Gly-Rink Amide AM树脂； 2) 以Gly-Rink Amide AM树脂为载体，以DIC/H0BT为缩合试剂，按照Fmoc/tbu固相多肽 合成的方法在Gly-Rink Amide AM树脂上偶联Fmoc-Orn(Boc)-OH; 3) 再按照上述方法依次偶联 Fmoc-Pro-OH、Fmo c_Cy s (Trt)-OH、Fmoc-Asp (Otbu)-OH、 Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ile_0H、Fmoc-D-Tyr(Et)-〇H、Mpa(Trt)-OH; 4) 用碘进行固相环化； 5) 用裂解试剂进行切割得醋酸阿托西班杂质D粗肽，用乙醚沉淀粗肽； 6) 用反相高效液相色谱法纯化分离，再经浓缩、冻干后即得所述的醋酸阿托西班杂质 D06. -种醋酸阿托西班杂质E的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括如下步骤： 1) 以Wang树脂为起始物料，溶胀洗涤后，以DIC/H0BT为缩合试剂，将Fmoc-Gly-OH的羧 基与树脂的羟基以酯键相连，得到Fmoc-Gly-Wang树脂； 2) 以Fmoc-Gly-Wang树脂为载体，以DIC/H0BT为缩合试剂，按照Fmoc/tbu固相多肽合成 的方法在 Fmoc-Gly-Wang 树脂上偶联 Fmoc-Orn(Boc)-OH; 3) 再按照上述方法依次偶联 Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cy s (Trt)-OH、Fmoc-Asn (Trt)-OH、 Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ile_0H、Fmoc-D-Tyr(Et)-〇H、Mpa(Trt)-OH; 4) 用碘进行固相环化； 5) 用裂解试剂进行切割得醋酸阿托西班杂质E粗肽，用乙醚沉淀粗肽； 6) 用反相高效液相色谱法纯化分离，再经浓缩、冻干后即得所述的醋酸阿托西班杂质 E07. -种权利要求1所述的醋酸阿托西班杂质的序列检测方法，其特征在于，所述的序列 分析方法为采用MS/MS测序。8. 根据权利要求7所述的序列检测方法，其特征在于，所述的采用MS/MS测序为采用傅 里叶变换离子回旋共振质谱分别对杂质A、杂质B、杂质C、杂质D或杂质E进行一级质谱扫描， 得到分子离子峰，然后对准分子离子峰施加能量裂解，得到该分子离子峰的二级质谱碎片 信息，通过分析软件分析确定杂质的序列结构。9. 根据权利要求7或8所述的序列分析方法，其特征在于，杂质A、杂质B、杂质C、杂质D和 杂质E的一级质谱分子离子峰分别为1010.44275、1010.43629、994.43356、995.42536和 995.42429。10. -种权利要求1所述的醋酸阿托西班杂质A、杂质B、杂质C、杂质D和/或杂质E在醋酸 阿托西班质量检测中作为杂质对照品的应用。
【文档编号】G01N33/68GK105949283SQ201610396692
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年6月7日
【发明人】钟正明, 彭涛, 王玲
【申请人】海南合瑞制药股份有限公司