苯噻菌酯抗体特异性结合的多肽及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及具有与苯噻菌酯抗体特异性结合的多肽，包括所 述多肽在检测苯噻菌酯中的应用。
【背景技术】
[0002] 苯噻菌醋（benzothiostrobin)是由华中师范大学研发的一种新型Strobilurins 类杀菌剂。苯噻菌酯具有杀菌谱广，杀菌活性高，施用量低，持效期长等优点，具有保护及治 疗作用，对作物白粉病、霜霉病均表现出优越的防效，具有良好的市场开发前景。为预防苯 噻菌酯应用存在的潜在风险，需要一种灵敏、快速、选择性的残留检测方法。
[0003] 目前，对苯噻菌酯的残留检测包括仪器分析方法和免疫分析法。免疫检测方法具 有快速、廉价、简便、灵敏、特异的优点，在大量样品快速筛选和现场监测中显示出独特优 势。由于农药等小分子化学品（包括苯噻菌酯）为单抗原决定簇分析物，整个分子只能和一 个抗体结合，所以通常选择竞争模式来建立免疫分析方法。在竞争模式的免疫分析方法中， 必须存在一个经过标记的竞争物，通常是将半抗原与蛋白、酶或荧光物等连接制备获得。根 据竞争物与免疫抗原结构的同异，可以将分析方法分为同源和异源免疫分析，在之前的大 量研宄中显示，异源免疫分析的敏感性要远远优于同源免疫分析。敏感性是评价一种检测 方法优劣的重要参数，同时高敏感性是免疫分析技术在样品处理过程中选择快速的稀释样 品方法的前提条件。但是系列异源半抗原的化学合成及半抗原与蛋白、酶或荧光物等的连 接需要很大的工作量。因此，已报道的苯噻菌酯的免疫分析都为同源免疫分析。
[0004] 自从噬菌体展示技术第一次报道至今，已经作为一种强大的工具运用在不同的研 宄中，包括筛选抗体和酶的配体；筛选小分子的受体；抗体工程等。其原理是将多肽或蛋白 质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确 且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合 蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相对独 立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。利用抗体对噬菌体展示随机多肽 库进行亲和淘选，可筛选出能够和抗体结合的噬菌体展示多肽。由于筛选出的多肽连接在 噬菌体外壳蛋白上，并且抗噬菌体的二抗已商品化，所以筛选出的噬菌体展示多肽不需要 与蛋白、酶或荧光物等连接，可直接用作竞争物建立异源竞争免疫分析。与化学合成竞争物 相比，从噬菌体展示随机多肽库中淘选竞争物具有操作简单、候选竞争物多、易于制备高质 量的竞争物。同时，噬菌体展示多肽竞争物还具有无毒、容易大量制备和纯化的优点。但目 前为止，尚未见具有与苯噻菌酯抗体特异性结合的多肽及其应用的研宄和报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供与苯噻菌酯抗体特异性结合的多肽，及相关多肽在苯噻菌酯 检测中的应用。
[0006] 本发明的目的通过下述技术方案予以实现：
[0007] (1)将蛋白A柱纯化的苯噻菌酯抗体包被在酶标板上，用3% BSA封闭酶标板，将 噬菌体展示随机环八肽库加入包被和封闭后的酶标板中进行亲和淘选，淘选过程按照"吸 附-洗涤-洗脱-扩增"的循环进行，一般经过3轮的淘选，每轮淘选降低用于竞争洗脱的 苯噻菌酯的含量；
[0008] (2) 3轮淘选后，挑选48个噬菌体克隆进行ELISA初步鉴定，29个阳性克隆进行扩 增、质粒提取、测序，共发现20种序列，其序列如SEQ ID NO 1~20所示：Cys Pio Ala Thr Pro Leu Gly Ser Leu CysiCys Lys Gly Thr Pro Met Gly Ser Leu CysiCys Ser Gly Leu Ala Glu Phe Met Ser CysiCys Thr Gly Leu Ala Pro Phe Met Lys CysiCys Leu Ala Gly Ala Asp Phe His Val CysiCys Pro He Gly Ala Trp Tyr His lie Cys，Cys Pro Gln Gly Ala Trp His His Leu Cys，Cys Pro Ser Thr Tyr Leu Pro Gly Ala Cys?Cys Pro Trp Tyr Tyr Leu Pro Gly Phe CysiCys Pro Trp Pro Trp Ala Thr Pro Leu CysiCys Pro Trp Tyr Val Pro Gln Gly Ser CysiCys Gly Thr Pro Tyr Gly Ser Leu Lys CysiCys Glu Gly Pro Leu Arg Ser lie Asn Cys，Cys Leu Thr His Ala Asp Leu Asp Tyr Cys，Cys Gln Thr Ala Phe Gly Met Leu Pro CysiCys He Tyr His Glu Gly His Ser Met CysiCys Pro Asn Thr Trp lie Ala His Ala Cys，Cys Leu Pro Gln His Leu Leu Ala Ser Cys，Cys Met Leu Gly Pro Arg Asp Asn Glu Cys，Cys lie Pro Asn Met Met Gly Arg Ser Cys ;所述多肽由 10 个氨基酸组成，包含一个环状肽区域；该环肽区域由多肽两端的半胱氨酸残基形成的二硫 键而被环化。
[0009] 本发明所述的多肽可与苯噻菌酯抗体组合，建立异源竞争ELISA，用于苯噻菌酯在 环境与农产品中的残留检测。
[0010] 本发明具有以下有益效果：（1)新颖：与苯噻菌酯抗体特异性结合的多肽为国内 外首次报道；(2)实用：利用本发明提供的噬菌体展示多肽可以快速建立高敏感性的异源 竞争ELISA ; (3)特异性强：利用本发明提供的噬菌体展示多肽实现的竞争ELISA与苯噻菌 酯类似物的交叉反应均小于0.34% ; (4)准确度高：利用本发明提供的噬菌体展示多肽实 现的竞争ELISA在农产品中的添加回收率为67. 6-119. 6 %，变异系数低于13. 7 %，符合残 留分析标准；（5)灵敏度高：利用本发明提供的噬菌体展示多肽实现的竞争ELISA的抑制中 浓度（IC5tl)为 0· 94ng/mL，检测限（IC1Q，L0D)为 0· 22ng/mL。
【附图说明】
[0011] 图1是挑选的48个噬菌体克隆P-ELISA检测的结果；横坐标为噬菌体克隆，纵坐 标为OD45tl值；
[0012] 图2是竞争P-ELISA检测苯噻菌醋，OD值与苯噻菌酯浓度的曲线；横坐标为苯噻 菌酯的浓度，单位为ng/mL ;纵坐标为OD45tl值。
【具体实施方式】
[0013] 本发明实施例中所用实验材料、主要试剂及配方如下：
[0014] 主要实验材料：
[0015] 蛋白A柱纯化苯噻菌酯单克隆抗体由南京农业大学，植物保护学院，农药残留与 环境毒理实验室制备；噬菌体展示随机环八肽库由美国加州大学-戴维斯分校，Hammock实 验室提供。
[0016] 主要试剂：
[0017] 蛋白胨（OXOID)、酵母提取物（OXOID)、琼脂（Amresco)、琼脂糖（Amresco)、四甲基 联苯胺（Sigma)、IPTG (Amresco)、Xgal (Amresco)、PEG8000 (Sigma)、辣根过氧化物酶标记的 抗Ml3单克隆抗体（GE)
[0018] 主要试剂配方：
[0019] 1、LB培养基：每升含IOg蛋白胨，5g酵母提取物，5gNaCl，高压灭菌，室温贮存；
[0020] 2、LB/IPTG/Xgal平板：LB培养基+15g/L琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70°C时， 加入ImL IPTG/Xgal，混匀倒平板。平板4°C避光贮存；
[0021] 3、顶层琼脂：每升含IOg蛋白胨，5g酵母提取物，5g NaCl，7g琼脂粉。高压灭菌， 固体培养基室温贮存，用时微波炉融化；
[0022] 4、四环素贮液：以20mg/mL的浓度溶于50%乙醇中，-20°C避光贮存，用前摇匀；
[0023] 5、LB-Tet平板：LB培养基+15g/L琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70°C时，加入 ImL四环素贮液，混匀倒平板，平板4°C避光贮存；
[0024] 6、封闭液：含有 3% BSA，0. 15M，pH 7. 4PBS，过滤除菌，4°C保存；
[0025] 7、PEG/NaCl :20% (w/v)PEG-8000,2. 5M NaCl，高压灭菌，室温贮存；
[0026] 8、IPTG/Xgal 配方：将 I. 25g IPTG (isopropyl β-D-thiogalactoside)和 Ig Xgal 溶于25mL二甲基甲酰胺中，-20°C避光贮存；
[0027] 9、显色液（四甲基联苯胺-H2O2底物溶液）：25mL 0· 1M，pH 5. 5柠檬酸盐缓冲液 中加入0. 4mL，6mg/mL四甲基联苯胺，0.1 mL 1 % H202。
[0028] 实施例1苯噻菌酯抗体特异性结合多肽的淘选和制备
[0029] 1、与苯噻菌酯抗体特异性结合的噬菌体克隆的淘选
[0030] 按照"吸附-洗涤-洗脱-扩增"的循环进行，经过3轮的淘选，具体操作如下：
[0031] (1)取100 μ L 10 μ g/mL蛋白A柱纯化的苯噻菌酯抗体加入酶标板中，4°C包被过 夜，共三个孔；
[0032] (2)取少量大肠杆菌ER2738涂在LB+Tet平板上，37°C过夜培养；
[0033] (3)将步骤（1)的酶标板用PBST洗涤5遍，加入300 μ L 3% BSA，37°C孵育1小 时，用PBST洗涤5遍，存放于4°C备用；
[0034] (4)将酶标板每孔加入2 X IO11的噬菌体（100 μ L)，室温轻微震荡1小时；
[0035] (5)取20mL LB培养基加入250mL三角瓶中，加入ER2738单菌落，37 °C培养至OD6tltl为 0.01 至 0.05 ;
[0036] (6)将步骤（4)的微孔用PBST洗涤10遍，加入100 μ L 10 μ g/mL的苯噻菌酯进行 洗脱，室温轻微震荡1小时；
[0037] (7)收集步骤（6)中的洗脱缓冲液，4°C保存；
[0038] (8)取少量脱液测定噬菌体的滴度（操作方法见滴度测定）；
[0039] (9)剩余的洗脱缓冲液用于扩增，将剩余的洗脱缓冲液加入步骤（5)中的三角瓶 中，37°C摇床培养4至4. 5小时；
[0040] (10)将扩增的噬菌体移入50mL的离心管中，4°C 12