特异性识别天冬酰胺合成酶的单克隆抗体的制作方法
【专利摘要】本发明的课题在于：提供适合于细胞内的天冬酰胺合成酶的定量分析的单克隆抗体。根据本发明，提供特异性识别细胞内存在的天冬酰胺合成酶的单克隆抗体。
【专利说明】特异性识别天冬酰胺合成酶的单克隆抗体
【技术领域】
[0001]本发明涉及特异性识别天冬酰胺合成酶的单克隆抗体、以及使用上述抗体的天冬酰胺合成酶测定试剂和天冬酰胺合成酶的测定方法。
【背景技术】
[0002]天冬酰胺合成酶(ASNS)在生物体内通过以L-谷氨酰胺为氮源的ATP依赖性反应催化由L-天冬氨酸到L-天冬酰胺的生物合成[非专利文献I]。因此，L-天冬酰胺并不是必须从体外摄入的必需氨基酸。在正常细胞内，当L-天冬酰胺的供给量减少时，可以通过合成L-天冬酰胺来补充。但是，由于淋巴母细胞的ASNS活性不充分，所以必须从外部摄入L-天冬酰胺[非专利文献2]。L-天冬酰胺酶(ASN ase)是将L-天冬酰胺水解成L-天冬氨酸和氨的酶[非专利文献3]，在许多急性淋巴性白血病(ALL)治疗中是重要的药物。给予ASNase使血液、髓液、骨髓的L-天冬酰胺枯竭，甚至使细胞内的L-天冬酰胺枯竭。ASNS水平非常低的淋巴母细胞容易发生细胞死亡。在体外系统中，通过将淋巴母细胞暴露在ASNase下来停止Gl期，引起细胞凋亡[非专利文献4]。研究显示:通过人ASNS的过剩表达，足以诱导ASNase抗性[非专利文献5]。不仅在白血病细胞中在卵巢癌细胞中也确认到ASNS表达量与ASNase敏感性的关系[非专利文献6和7]。这些现象暗示了作为确定ASNase治疗的诊断标志物的ASNS活性监测的重要性。ASNase抵抗性与ASNS mRNA表达量的关系已被广泛报道[非专利文献8]，但确定人白血病中的ASNS蛋白量的研究却少[非专利文献9-13]。其中，还有关于ASNase敏感性预测显示出ASNS蛋白测定的重要性的报道[非专利文献13]。
[0003]以昆虫细胞株Sf9为宿主的杆状病毒表达系统被用于蛋白的大量制备。特别是，包括我们在内的众多研究者表明:不仅在Sf9细胞中、在芽生型杆状病毒(BV)颗粒中也可以展示与膜蛋白或病毒gp64蛋白形成的融合蛋白。因此，在BV中展示的外源性蛋白不用纯化抗原蛋白即可用于免疫[非专利文献14、15、16]。
[0004]现有技术文献非专利文献
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【发明内容】
[0005] 发明所要解决的课题如上所述，L-天冬酰胺酶(ASNase)对小儿急性淋巴细胞性白血病(ALL)的治疗颇为重要。据报道，ASNase敏感性与ALL细胞株中所含的天冬酰胺合成酶(ASNS)的蛋白量有关。但是，由于没有适合于定量分析的单克隆抗体，所以报道ASNS蛋白量的例子少。本发明所要解决的课题在于:提供适合于定量分析细胞内的天冬酰胺合成酶的单克隆抗体。
[0006]用于解决课题的手段
本发明人为了解决上述课题进行了深入研究，结果成功制作了可以适应流式细胞术或酶联免疫吸附法(ELISA)、且特异性识别天冬酰胺合成酶的单克隆抗体。利用该单克隆抗体，可以定量白血病细胞的ASNS蛋白量，预测ASNase抵抗性。本发明基于上述认知而完成。
[0007]即，根据本发明，提供以下的发明。
[0008](I)单克隆抗体，该单克隆抗体特异性识别细胞内存在的天冬酰胺合成酶。
[0009](2) (I)所述的单克隆抗体，其识别天冬酰胺合成酶的N末端的氨基酸序列。
[0010](3)单克隆抗体，其是具有保藏号NITE BP-1141或保藏号NITE BP-1142的杂交瘤产生的单克隆抗体。
[0011](4)杂交瘤，该杂交瘤具有保藏号NITE BP-1141或保藏号NITE BP-1142。
[0012](5)用于测定细胞内存在的天冬酰胺合成酶的试剂，该试剂包含⑴~(3)中任一项所述的单克隆抗体。
[0013](6)测定细胞内存在的天冬酰胺合成酶的方法，该方法包括:使(I)~(3)中任一项所述的单克隆抗体与包含天冬酰胺合成酶的细胞接触的步骤。
[0014](7) (6)所述的方法，该方法测定白血病细胞或卵巢癌细胞中存在的天冬酰胺合成酶。
[0015](8)利用(6)或(7)所述的方法测定天冬酰胺合成酶，根据上述测定的结果来评价白血病或卵巢癌的L-天冬氨酸激酶的敏感性的方法。
[0016]发明效果
在本发明中，使用杆状病毒提呈系统，成功制作了特异性识别细胞内存在的天冬酰胺合成酶的单克隆抗体。本发明的单克隆抗体可以在蛋白质印迹法、免疫荧光染色、流式细胞术、酶联免疫吸附法(ELISA)中识别人天冬酰胺合成酶。通过使用本发明的单克隆抗体，可以定量测定白血病细胞内的天冬酰胺合成酶蛋白，临床评价白血病的ASNase敏感性。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1显示使用所制作的单克隆抗体的蛋白质印迹。(A) N-AS融合蛋白的表达确认。抗gp64单克隆抗体K7124以1、0.3、0.1//g/ml的浓度进行使用。箭头指向N-AS融合gp64的条带。上画面()' 木几)为N-AS-BV、下画面为野生型BV。(B)与N-AS融合蛋白的反应性。对照小鼠IgG和抗ASNS单克隆抗体Z5801、Z5808以1,0.3,0.1u g/ml的浓度进行使用。上画面为N-AS-BV、下画面为野生型BV。(C)与HA-ASNS过剩表达C0S7细胞增溶物的反应性。每一泳道通过SDS-PAGE分离增溶了 14个细胞的蛋白。(+) =HA-ASNS转染细胞增溶物的上样泳道、(-):非转染细胞增溶物的上样泳道。以1# g/ml的浓度使用对照小鼠IgG、抗HA单克隆抗体(Sigma)、抗ASNS单克隆抗体Z5801、Z5808作为一次抗体。(D)与内源性ASNS的反应性。每个泳道通过SDS-PAGE分离增溶了 15个细胞的蛋白。以I// g/ml使用Z5808作为一次抗体。箭头显示内源性ASNS的条带；图2显示HA-ASNS过剩表达C0S7细胞的免疫荧光染色。混合作为一次抗体的兔抗HA多克隆抗体(Sigma)和小鼠抗ASNS单克隆抗体(Z5801或Z5808)使分别达到10// g/ml,以进行反应。绿色是用Alexa fluor 488的突光显示HA-ASNS的表达。红色是用Alexa fluor647的荧光显示抗ASNS抗体与HA-ASNS的反应性。蓝色显示被DAPI染色的细胞核；
图3显示抗ASNS单克隆抗体对流式细胞术的适应。(A) HA-ASNS转染C0S7细胞的流式细胞术分析。全面涂色的柱形图显示HA-ASNS转染C0S7细胞、空白的柱形图显示未转染C0S7细胞。以3// g/ml的浓度使用对照小鼠IgG、抗HA单克隆抗体(Sigma)、抗ASNS单克隆抗体Z5801、Z5808作为一次抗体。箭头是用偏移(7卜)的柱形图显示表达HA-ASNS的C0S7细胞。(B)内源性ASNS的流式细胞术分析。全面涂色的柱形图显示使一次抗体进行反应的细胞、空白的柱形图显示仅使二次抗体进行反应的细胞。一次抗体以3// g/ml的浓度进行使用；
图4显示K562细胞内ASNS蛋白的定量。(A) QIFIKIT(注册商标)校正珠的柱形图。6 种珠粒的抗体结合能力(Antibody Binding Capacity (ABC))分别如下。A:0、B:1800、C:12, 000,D:53, 000,E:185, 000,F:530, 000。(B)以重对数图尺显示 4 种校正珠(B-E)的平均突光强度(MFI,Mean Fluorescence Intensity)对ABC的标准曲线。(C) ASNS测定夹层ELISA的构建。全面涂色的圆表示与K562细胞提取液的反应性、空白的圆表示与M0LT-4细胞的稀释系列的反应性。数据显示二重测定的平均值。(D)在任意ASNS浓度和450nm的吸光度下显示的标准曲线。当A450为0.23时ASNS浓度的检测限为11.3fmol/ml ；
图5显示M0LT-4和K562的流式细胞术的结果和」MFI差异；
图6显示芽球比例为34.5%的病例I的流式细胞术结果；
图7显示芽球比例为34.5%和24.5%的病例I和病例2的流式细胞术结果；
图8显示病例3 (骨髓液和外周血)的流式细胞术结果；
图9显示病例4 (AML病例)的流式细胞术结果；
图10显示病例6和病例7 (ALL病例)的流式细胞术结果；
图11显示3个病例(病例5、病例6、病例7)的细胞株的MTT测定结果。
【具体实施方式】
[0018]以下，对本发明进行更详细的说明。
[0019]本发明的抗体是特异性识别细胞内存在的天冬酰胺合成酶的单克隆抗体，优选为识别天冬酰胺合成酶的N末端的氨基酸序列的单克隆抗体。在本发明的实施例中，作为取得抗体的方法，没有采用作为常规方法的普通的免疫方法，而是采用了在芽生型杆状病毒中提呈ASNS的N末端片段的抗原(BV抗原)对gp64表达转基因小鼠进行免疫的方法。SP，作为本发明的获得单克隆抗体的方法的优选例子，可以列举:通过使用从宿主细胞的培养上清中回收的N末端ASNS提呈芽生型杆状病毒作为抗原对免疫动物进行免疫来获得单克隆抗体的方法，所述宿主细胞感染了包含ASNS的N末端片段的cDNA的重组杆状病毒。优选免疫动物为过剩表达gp64的转基因小鼠。
[0020]如上所述，在本发明中，使用从宿主细胞的培养上清中回收的提呈ASNS或其片段的芽生型杆状病毒作为抗原，所述宿主细胞感染了包含ASNS或其片段(N末端片段等)的cDNA的重组杆状病毒。用作抗原的芽生型杆状病毒的制备方法众所周知，例如可以按照日本特开2001-333773号公报、日本特开2003-52370号公报、Loisel TP, AnsanayH, St-Onge S，Gay B, Boulanger P, Strosberg AD, Marullo S，Bouvier M., NatB1technol.1997 Nov; 15(12):1300-4., Recovery of homogeneous and funct1nalbeta 2-adrenergic receptors from extracellular baculovirus particles:以及国际公开W098/46777等中记载的方法来进行。
[0021]具体而言，使用包含ASNS或其片段(N末端片段等)的cDNA的至少一种重组杆状病毒。作为使昆虫感染而生病的病毒的杆状病毒，是携带环状双链DNA作为基因的有包膜病毒，对鳞翅目、膜翅目和双翅目等的昆虫显示出敏感性。作为本发明中使用的杆状病毒，NPV的金翅夜蛾亚科的苜猜银纹夜蛾(Autographa californica)NPV(AcNPV)或香的家蚕(Bombyx mori)NPV(BmNPV)等的病毒可以用作载体。作为AcNPV的宿主(感染、继代细胞)，可以列举草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞(Sf细胞)等,作为BmNPV的宿主(感染、继代细胞)，可以列举BmM细胞等。与BmM细胞等相比Sf细胞的增殖速度快，而且AcNPV对人肝细胞和人胚肾细胞等也具有感染能力，因此优选AcNPV系的载体。作为宿主，草地贪夜蛾细胞系统Sf9和Sf21等已由草地贪夜蛾幼虫的卵巢组织确立，可以从Invitrogen公司或Pharmingen公司(San Diego, CA)或ATCC等获取。而且,还可以使用活的昆虫幼虫作为宿主细胞系统。
[0022]本发明中使用的重组病毒的构建方法可以按照常规方法进行，例如可以按照以下程序进行。首先，将想要表达的蛋白的基因插入转移载体中，以构建重组转移载体。转移载体整体的大小通常为数kb~1kb左右，其中的约3kb是来自质粒的骨架，包含氨苄青霉素等抗生素抗性基因和细菌的DNA复制开始的信号。在普通的转移载体中，除该骨架以外，还包含数kb的多角体基因的5’区和3’区，进行如下所述的转染时，在该序列间在目标基因和多角体基因之间发生同源重组。另外，转移载体中优选包含用于表达蛋白基因的启动子。作为启动子，可以列举多角体基因的启动子、PlO基因的启动子、衣壳蛋白基因的启动子等。对转移载体的种类没有特别限定。作为转移载体的具体例子，作为AcNPV系转移载体，可以列举 pEVmXIV2、pAcSGl、pVL1392/1393、pAcMP2/3、pAcJPl、pAcUW21、pAcDZl、pBlueBacII1、pAcUW51、pAcAB3、pAc360、pBlueBacHis、pVT-Bac33、pAcUWl、pAcUW42/43 等；作为 BmNPV 系转移载体，可以列举 pBK283、pBK5、pBB30、pBEl、pBE2、pBK3、pBK52、pBKblue、pBKblue2、pBF系列(上述载体可以从Funakoshi株式会社等获取)等。
[0023]接下来，为了制作重组病毒，将上述的重组转移载体与病毒混合，之后转移到用作宿主的培养细胞中，或者，将上述转移载体转移到预先被病毒感染的用作宿主的培养细胞中，在重组转移载体和病毒基因组DNA之间发生同源重组，构建重组病毒。这里用作宿主的培养细胞可以列举上述的宿主，通常是指昆虫培养细胞(Sf9细胞或BmN细胞等)。培养条件由本领域技术人员适当确定，具体而言，当使用Sf9细胞时，优选使用包含10%胎牛血清的培养基在28°C左右进行培养。如此操作而构建的重组病毒可以通过常规方法、例如噬菌斑测定等进行纯化。需要说明的是，如此操作而制作的重组病毒，其在核多角体病病毒的多角体蛋白的基因区事先取代或插入有外来的DNA，无法形成多角体，因此可以容易地与非重组病毒进行区别。
[0024] 在本发明的方法中，可以用上述的重组杆状病毒感染上述的适当的宿主(草地贪夜蛾细胞系统Sf9和Sf21等的培养细胞、或昆虫幼虫等)，一定时间后(例如，72小时后等)，通过离心等分离操作从培养上清中回收细胞外芽生型病毒(budded virus, BV)。细胞外芽生型杆状病毒的回收例如可如下进行。首先，以500~3，OOOg的离心力离心分离感染细胞的培养液，回收包含细胞外芽生型杆状病毒的上清。将该上清以约30，000~50，OOOg的离心力进行离心分离，可以得到包含细胞外芽生型杆状病毒的沉淀物。
[0025]对本发明的抗体的种类没有特别限定，可以适当使用小鼠抗体、大鼠抗体、兔抗体、绵羊抗体、骆驼抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体等。抗体为单克隆抗体。单克隆抗体可以通过本领域技术人员所周知的方法来制作。产生单克隆抗体的杂交瘤基本上可以利用公知技术如下制作。即，使用所期望的抗原或表达所期望的抗原的细胞作为致敏抗原，按照普通的免疫方法对其进行免疫，再通过普通的细胞融合法使得到的免疫细胞与公知的亲本细胞融合，利用普通的筛选方法筛选产生单克隆抗体的细胞(杂交瘤)，从而可以制作杂交瘤。作为被免疫的动物，例如可以使用小鼠、大鼠、兔、绵羊、猴等哺乳动物。
[0026]杂交瘤的制作例如可以按照Milstein等人的方法(Kohler.G.和Milstein, C.，Methods Enzymol.(1981) 73: 3-46)等进行。
[0027]关于杂交瘤的筛选，可以采用ELISA测定、蛋白质印迹分析、放射性免疫测定、使用了表达ASNS的细胞的FACS等该【技术领域】所熟知的方法，选择产生识别ASNS的抗体的杂交瘤细胞。可以克隆分泌所期望的抗体的杂交瘤，在适当的条件下培养，回收所分泌的抗体，再利用该【技术领域】所熟知的方法、例如离子交换柱、亲和层析等进行纯化。
[0028]编码单克隆抗体的DNA可以通过惯用的方法(例如，使用可与编码单克隆抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)容易地进行分离和序列确定。
[0029]可以使用下述抗体:由杂交瘤克隆抗体基因，将其插入适当的载体中，再将其导入宿主中，利用基因重组技术而产生的基因重组型抗体。具体而言，使用逆转录酶由杂交瘤的mRNA合成抗体可变区(V区)的cDNA。得到编码目标抗体V区的DNA时，将其与编码所期望的抗体恒定区(C区)的DNA连接，将其插入表达载体中。或者，可以将编码抗体V区的DNA插入包含抗体C区的DNA的表达载体中。插入到在表达调节区、例如增强子、启动子的调节下表达的表达载体中。接下来，可以通过该表达载体转化宿主细胞，使抗体表达。
[0030]如上所述，暂且分离抗体基因，将其导入到适当的宿主中以制作抗体时，可以使用适当的宿主与表达载体的组合。使用真核细胞作为宿主时，可以使用动物细胞、植物细胞、真菌细胞。作为动物细胞，已知有⑴哺乳类细胞、例如CHO、COS、骨髓瘤、BHK(幼仓鼠肾)、HeLa、Ve1 ;(2)两栖类细胞、例如非洲爪蟾卵母细胞；或者(3)昆虫细胞、例如sf9、sf21、Tn5等。作为植物细胞，已知有来自烟草(Nicotiana)属、例如烟草(Nicotianatabacum)的细胞，可以对其进行愈伤组织培养。作为真菌细胞，例如已知有酵母、例如酵母(Saccharomyces)属、例如啤酒酵母(Saccharomyces serevisiae);丝状菌、例如曲霉(Aspergillus)属、例如黑曲霉(Aspergillus niger)等。使用原核细胞时,有使用细菌细胞的产生系统。作为细菌细胞，已知有大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌。通过转化将目标抗体基因导入到这些细胞中，在体外培养被转化的细胞，从而得到抗体。
[0031] 另外，这些抗体只要不失去识别ASNS蛋白的特性即可，可以是抗体片段(片段)等低分子化抗体或抗体的修饰物等。作为抗体片段的具体例子，例如可以列举Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、双抗体等。为了得到这样的抗体片段，可以构建编码这些抗体片段的基因，将其导入表达载体中，之后使之在适当的宿主细胞中表达。作为抗体的修饰物，还可以使用与聚乙二醇(PEG)等各种分子结合的抗体。
[0032]如上所述，所表达、产生的抗体可以通过通常蛋白的纯化中使用的公知方法进行纯化。例如，可以通过将蛋白A柱等亲和柱、层析柱、滤器、超滤、盐析、透析等适当选择并组合来分离、纯化抗体。
[0033]本发明的抗体可用于测定细胞内存在的天冬酰胺合成酶。即，根据本发明，提供测定细胞内存在的天冬酰胺合成酶的方法，该方法包括:使本发明的抗体与包含天冬酰胺合成酶的细胞接触的步骤。特别是，通过使用本发明的抗体，可以评价每I个细胞的天冬酰胺合成酶(ASNS)的分子数。在本发明中，特别是，测定淋巴母细胞等白血病细胞或卵巢癌细胞中存在的天冬酰胺合成酶的量，根据得到的测定结果，可以评价白血病或卵巢癌中的L-天冬氨酸激酶的敏感性。
[0034]通过以下的实施例来进一步具体说明本发明，但本发明并不受实施例的限定。实施例
[0035]实施例1:
(I)材料和方法
(1-1)抗原(N末端ASNS展示BV)的制备和免疫方法
关于ASNS的N末端区(2~51个氨基酸残基，以下记作N-AS)的cDNA，以人胎脑 Marathon-R eady cDNA(Clontech)为模板，使用 5’ -AACTGCAGTGTGGCATTTGGGCGCTGTTT-3’ (SEQ ID NO:1)和 5，-CCGCCAACCGGTGAAATCCA-3’ (SEQ ID NO: 2)作为引物，通过PCR法进行扩增，并与gp64基因连接。导入有N-AS基因的重组病毒的制备按照上述非专利文献15和16的记述来进行。自感染起72小时后，通过40，000g、40分钟的离心分离，从Sf9培养液中回收该芽生型病毒(N-AS-BV)，将其用作免疫原。为了避免与gp64的免疫反应，按照非专利文献16的记述将gp64转基因小鼠用于免疫。在70// g N-AS-BV中混合0.1// g百日咳毒素作为佐剂，向gp64转基因小鼠的腹腔内给药，进行免疫。再以两周的间隔给予不含佐剂的70// g N-AS-BV两次，进行追加免疫。自最终免疫起3天后分离脾细胞，按照标准方法将其以1:10的混合比与小鼠骨髓瘤细胞NS-1进行细胞融合。融合细胞用HAT选择培养基(0.1mM的次黄嘌呤、0.1mM的氨基蝶呤和0.16mM的胸苷)培养7天。自细胞融合起8天后，回收杂交瘤的培养上清，利用针对N-AS-BV的ELISA和蛋白质印迹法选择产生抗体的细胞。使用了抗原表达BV的ELISA按照非专利文献16的记述来进行。
[0036](1-2)细胞株和基因导入株
K562细胞和M0LT-4细胞从理研CELL BANK购入。K562细胞在F_12 NutrientMixture (Ham，s F-12)培养基(Invitrogen)中、MOLT-4 细胞在 RPMI 1640 培养基中、且在分别包含10%胎牛血清和青霉素链霉素的7%C02、37°C的条件下进行悬浮培养。为了制备带HA标签的人ASNS,以人胎脑Marathon-Ready cDNA(Clontech)为模板，使用5’-GAAGATCTA TGTGTGGCATTTGGGCGCTG-3’(SEQ ID NO: 3)和5’-GAAGATCTCTAAGCTTTGACAGCTGACTTG-3’(SEQ ID NO: 4)作为引物，通过 PCR 法扩增人 ASNS cDNA，将其与 pEF-BOS-HA载体[非专利文献17]连接。关于表达构建物，使用Lipofectamine (注册商标)2000试剂(Invitrogen)，按照制造商的说明书将其转染(基因导入)到C0S7细胞(ATCC)中。
[0037](1-3)蛋白质印迹法回收细胞，用RIPA缓冲液(150mM的NaCl、1%的NP_40、0.1%的SDS、50mM的Tris-HCl (pH7.9)、0.5%的脱氧胆酸钠)溶解。溶解液中的蛋白通过12%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，转印到硝基纤维素膜(GE healthcare)上。用Block Ace (大日本Pharma)封闭与转印膜的非特异性结合，使其与一次抗体反应。用TBS-T (0.05%的Tween20/10mM的Tris缓冲液生理盐水)清洗后，使转印膜与稀释了 I万倍的辣根过氧化物酶(HRP)-缀合山羊抗小鼠抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories)反应，使用 SuperSignal WestDura Extended Durat1n Substrate (持久性化学发光底物)(Thermo)进行检测。检测gp64融合蛋白时，用野生型杆状病毒进行免疫，使用我们制作的gp64蛋白特异性抗体K7124[非专利文献16]。对照IgG(3423、2AHB12)从特殊免疫研究所购入(日本东京)。
[0038](1-4)免疫荧光染色
在盖玻片上培养HA-ASNS转染C0S7细胞，之后用4%多聚甲醛/磷酸缓冲液生理盐水(PBS)固定，再用0.1%的Triton X-100/PBS进行透膜处理。用Block Ace封闭后，使细胞与作为一次抗体的抗HA多克隆抗体和抗ASNS单克隆抗体即Z5801或Z5808的混合液分别以10//g/ml进行反应,用PBS清洗后,将作为二次抗体的Alexa (注册商标)fluor 488标记抗兔 IgG(Invitrogen)和 Alexa (注册商标)fluor 647 标记抗小鼠 IgG (Invitrogen)的混合液分别以稀释2百倍进行反应。使用含有DAPI的ProLong (注册商标)Gold抗淬灭试剂 (Invitrogen)，将该盖玻片放在载玻片上。用荧光显微镜拍摄图像(LEICA DB LB, LeicaMicrosystems)。
[0039](1-5)流式细胞术
关于细胞的固定处理和透膜处理，使用IntraStain和流式细胞术固定/透化作用试剂盒(Fixat1n and Permeabilizat1n Kit for Flow Cytometry) (Dako),按照制造商的操作说明书来进行。在添加透膜处理试剂的同时添加一次抗体，使其达到3// g/ml。用稀释缓冲液(1%的BSA/0.1mM的EDTA/PBS)清洗该细胞，之后与将R-藻红蛋白(R-PE)标记抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch Labolatries)用稀释缓冲液稀释了 100倍而得到的稀释液反应。最后，用稀释缓冲液清洗细胞2次，使用流式细胞仪(GUAVA(注册商标)EasyCyteTMPlus System, Millipore)进行分析。
[0040](1-6)酶联免疫吸附法
将IX 17个细胞在0.1ml 0.2%的阜苷/蛋白酶抑制剂混合物(protease inhibitorcocktail) (Complete (注册商标)，Roche) /生理盐水中、在室温下进行15分钟的透膜处理，通过20，OOOXgUO分钟的离心分离除去细胞破碎物。使用该上清作为细胞提取液。[0041 ] 将单克隆抗体Z5801用生理盐水稀释至4// g/ml,固定在聚苯乙烯96孔板(Greiner)上。用Block Ace/生理盐水封闭后，向各孔中添加用反应液(0.1%的皂苷/50%的Block Ace/盐水)在20倍~160倍之间适当稀释的细胞提取液，使之在室温下反应2小时。接下来，用洗涤液(0.05%的Tween 20/生理盐水)清洗反应中使用的板5次，用反应液稀释生物素化单克隆抗体Z5808使其达到I" g/ml，作为检测抗体进行反应。关于生物素化，使用EZ-Link (注册商标)Sulfo-NHS-LC-B1tin (Thermo),按照制造商的操作说明书来进行。最后，清洗反应板，用反应液稀释链霉亲和素_PolyHRP40 (StereospecificDetect1n Technologies)使达到2千倍,之后添加在各孔中。在酶反应中,检测中使用TMB可溶性试剂(ScyTek Laboratories)。用 TMB 终止缓冲液(ScyTek Laboratories)停止酶反应，之后使用酶标仪(B1trak II, GE Healthcare)测定450nm的吸光度。
[0042](2)结果
(2-1)抗ASNS单克隆抗体的制作
N-AS与病毒gp64的融合蛋白的表达确认通过使用了抗gp64单克隆抗体K7124的蛋白质印迹来进行。该抗体识别N-AS-BV和野生型BV两者的64kDa条带(图1A)，还识别作为N-AS融合gp64蛋白的约70kDa (图1A上画面，箭头)。为了制作抗ASNS单克隆抗体，用该芽生型病毒(N-AS-BV)对gp64转基因小鼠进行免疫，将其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞NS-1进行细胞融合。自细胞融合起8天后，通过BV-ELISA和针对N-AS-BV的蛋白质印迹法选择杂交瘤培养上清。最终通过ELISA和蛋白质印迹法两种方法得到与N-AS-BV进行特异性反应的两个阳性克隆Z5801和Z5808 (图1B)。关于这些抗体的亚型，使用Mouse Typer (注册商标)亚-同种化试剂盒(B1-RAD)鉴定为是IgG2a、kappa。
[0043]产生单克隆抗体Z5801的杂交瘤细胞(用于识别的表示:Z5801)以保藏号:NITEP-1141于2011年9月7日保藏在独立行政法人产品评价技术基础机构专利微生物保藏中心(〒292-0818，日本国千叶县木更津市分镰足2-5-8)，并于2012年8月23日以保藏号=NITE ΒΡ-1141转移到布达佩斯条约下的国际寄托。
[0044]产生单克隆抗体Ζ5808的杂交瘤细胞(用于识别的表示:Ζ5808)以保藏号:ΝΙΤΕΡ-1142于2011年9月7日保藏在独立行政法人产品评价技术基础机构专利微生物保藏中心(〒292-0818、日本国千叶县木更津市分镰足2-5-8)，并于2012年8月23日以保藏号=NITE ΒΡ-1142转移到布达佩斯条约下的国际寄托。
[0045](2-2)抗ASNS抗体的特异性
使用HA- ASNS过剩表达C0S7细胞，确认对ASNS全长的反应特异性。在使用了该细胞增溶物的蛋白质印迹中，这些单克隆抗体与抗HA抗体所显示的一样，识别转染了 HA-ASNScDNA的细胞的分子量为64kDa的条带(图1C)。而且，关于Z5808，在K562细胞内还识别到内源性ASNS(图1D)。在免疫荧光染色中，这些单克隆抗体与抗HA抗体一样，识别表达HA-ASNS的细胞(图2)。
[0046](2-3)抗ASNS抗体对流式细胞术的适应
为了确认这些抗ASNS抗体是否可用于流式细胞术,使用Dako Intrastain试剂盒对HA-ASNS过剩表达C0S7细胞进行固定处理、透膜处理，之后用抗HA单克隆抗体、Z5801或Z5808单克隆抗体进行染色。抗ASNS单克隆抗体Z5801和Z5808与抗HA抗体一样，显示出特异性的柱形图偏移(图3A)。接下来，使用白血病细胞株K562和M0LT-4来确认这些抗体在流式细胞术中是否识别内源性ASNS。[非专利文献17]中报道了:在K562细胞株中ASNS的表达水平高，而在M0LT4细胞株中ASNS的表达水平非常低。无论哪一种单克隆抗体均特异性识别K562细胞，显示出柱形图偏移(图3B)。在流式细胞术中，Z5808的反应性较Z5801 1? ο
[0047](2-4)通过流式细胞术进行的ASNS蛋白的定量
关于流式细胞术定量法，使用QIFIKIT (注册商标)(Dako)，按照制造商的说明书来进行。最初，进行作为一次抗体的Z5808的K562细胞中的效价测定，确定饱和浓度为3// g/ml (数据未公开)。使用QIFIKIT (注册商标)的校正珠，由该浓度下的平均荧光强度(MeanFluorescence Intensity, MFI)求出每个细胞的单克隆抗体结合能力。6种校正珠和细胞一样用R-PE标记抗小鼠IgG抗体进行染色(图4A)。在该实验中，由于校正珠F超出了测定限，所以将校正珠B、C、D、E按照重对数图尺进行作图(图4B)。通过最小二乘法制作标准曲线，利用标准曲线，由样品的MFI值求出显示抗体结合能力的抗体结合能力(ABC)。为了定量K562细胞和M0LT-4细胞内的ASNS蛋白，估算3// g/ml的Z5808或对照IgG下的MFI值，用对照IgG进行补正。利用流式细胞仪分析细胞，根据标准曲线的算式算出ABC(图4B)。假设一个细胞内的ASNS分子量等于ABC，则以下的等式成立:
每个细胞内的ASNS分子=ABC(Z5808) 一 ABC (对照IgG)
估算的每个细胞的ASNS分子数如下:在K562细胞中为5800、在M0LT-4中为80 (表1)。
[0048][表 I]
在K562细胞、M0LT-4细胞中表达的ASNS分子数
【权利要求】
1.单克隆抗体，该单克隆抗体特异性识别细胞内存在的天冬酰胺合成酶。
2.权利要求1所述的单克隆抗体，该单克隆抗体识别天冬酰胺合成酶的N末端的氨基酸序列。
3.单克隆抗体，其是具有保藏号NITEBP-1141或保藏号NITE BP-1142的杂交瘤产生的单克隆抗体。
4.杂交瘤，该杂交瘤具有保藏号NITEBP-1141或保藏号NITE BP-1142。
5.用于测定细胞内存在的天冬酰胺合成酶的试剂,该试剂包含权利要求1~3中任一项所述的单克隆抗体。
6.测定细胞内存在的天冬酰胺合成酶的方法，该方法包括:使权利要求1~3中任一项所述的单克隆抗体与包含天冬酰胺合成酶的细胞接触的步骤。
7.权利要求6所述的方法，该方法测定白血病细胞或卵巢癌细胞中存在的天冬酰胺合成酶。
8.利用权利要求6或7所述的方法测定天冬酰胺合成酶，并根据上述测定的结果评价白血病或卵巢癌的L-天冬氨酸激酶的敏感性的方法。
【文档编号】C07K16/40GK104080810SQ201280049699
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2012年10月3日 优先权日:2011年10月3日
【发明者】浜洼隆雄, 望月康弘, 岩成宏子, 新井修, 鬼头敏幸, 鹤泽正仁 申请人:国立大学法人东京大学, 株式会社特殊免疫研究所, 学校法人爱知医科大学