担子菌的天冬酰胺酶的制作方法

专利名称：担子菌的天冬酰胺酶的制作方法
担子菌的天冬酰胺酶发明领域
本发明的领域涉及可自真菌担子菌获得的天冬酰胺酶，所述担子菌特别是担子菌绒状火燕(Flammulina velutipes)。还公开了用于水解L-天冬酰胺和L-谷氨酰胺的方法。还公开了用于降低包含L-天冬酰胺的物质中的丙烯酰胺形成的方法。发明背景
天冬酰胺酶在食品技术中的应用源于发现在存在还原糖类的条件下，对食品的热处理将天冬酰胺部分转化为丙烯酰胺。由于糖类在食品中与氨基酸一样普遍，因此在食品热处理的过程中，存在持续的风险产生致癌和遗传毒性的丙烯酰胺。热处理是例如对食物的烘焙、烤、炙烤或热油炸。在食品热处理过程中，在120°C以上的温度下观察到出现丙烯酰胺形成。考虑到丙烯酰胺的遗传毒性和致癌性，粮农组织/世界卫生组织食品添加剂专家委员会(JECFA)提出膳食暴露于丙烯酰胺可暗示人的健康问题(参见www.1nchem.org/ documents/jecfa/jeceval/jec_41. htm,见于 2010 年 7 月 I 日)。
食品工业对多种本身需要热处理的品种予以特殊关注，例如面包、曲奇、小食、饼干、谷物、烘干的种子(例如可可、咖啡)、挤压和切割的土豆产品。
食品的热处理对于食品质量而言是不可或缺的。例如食品的褐化(迈拉德反应) 反应形成了食品的典型风味、颜色和抗氧化剂。此外，由于热处理食品，可以实现食品的微生物安全性和延长的保存期。
能够在热处理食品前选择性的去除L-天冬酰胺是理想的。
已报道，使用反义天冬酰胺合酶基因和块茎特异性启动子对土豆进行遗传改造， 降低但不能从土豆块茎中消除天冬酰胺(Rommens 2007);完全消除天冬酰胺对于植物可能是致死的。
酶是理想的选择性工具，用于在不影响其他食物组分的条件下修饰食物组分。酶对食品的催化作用随高的底物和反应特异性以及酶反应的温和物理条件而不同。酶对食品的作用是更加环境友好的，因为不涉及有机溶剂或重金属(“绿色化学”;“白色生物技术”)。 用于修饰食物组分的酶能够改变单个食物组分，同时避免任何可能最终导致在食品中形成毒性化合物的副反应。
然而，目前尚无任何酶技术可设想用于从食物蛋白质中选择性水解蛋白质结合的氨基酸，例如天冬酰胺，而对于同时保持相应食物材料的典型结构和味觉特性来说则所述技术则更少。
理想的是水解例如食物中的游离的和可移动的天冬酰胺为天冬氨酸。则天冬酰胺之后不能作为食品热处理时形成丙烯酰胺的前体分子。
技术现状
天冬酰胺酶(EC 3. 5.1.1 ;L_天冬酰胺酰胺水解酶)是催化L-天冬酰胺水解为天冬氨酸，并释放氨的酶。根据定义，天冬酰胺酶作用于线性酰胺中的氮-碳键，而不作用于 L-天冬酰胺的肽键。
L-天冬酰胺是第一个被检测到的氨基酸(1806年，在石刁柏(Asparagusofficinalis)的汁中)，L-天冬酰胺普遍存在于所有的活细胞中。因此,从原核微生物至脊椎动物，自然界存在丰富的天冬酰胺酶；参见Halpern, Y. S.和Grossowicz,N. ,Hydrolysis of amides by extracts frommycobacteria, Biochem. J. 65 :716-720 (1957) ；Ho, P.P.K., Frank, B. H. ^PBurck, P. J. , Crystalline L-asparaginase from Escherichia coli B., Sciencel65 :510-512(1969) ；Suld, Η. M.和 Herbut, P. A. , Guinea pig serum andliver L-asparaginases—Comparison of serum and papain-digested IiverL-asparaginase. J. Biol. Chem. 245 :2797-2801 (1970)。具有326个氨基酸的大肠杆菌的四聚体天冬酰胺酶 (Jackson,R. Ch.和Handschumacher,R. Ε· ,Escherichia coli L-asparaginase. Catalytic activity and subunit nature, Biochemistry, 1970,9 (18),第 3585-3590 页)是首个被详细检测的。
直到近期为止，L-天冬酰胺酶才在癌症治疗中被用作cytostaticum,抵抗白血病细胞和肥大细胞肿瘤(Herbert F. Oettgen, L-asparaginase Einneues Prinzip in der Chemotherapie maligner Neoplasien, Annals ofHematology,1969,19(6), 351-356)。
最近，报道了源自细菌(幽门螺杆菌(Helicobacter pylori), Scotti等人， 2010 ；Pyrococcus furiosus, Greiner-Stoeffele and Struhalla, 2008)和霉菌(黑曲霉 (Aspergillus niger), Van der Laan 等人，2008 ;米曲霉(Aspergillus oryzae), Matsui 等人，2008)的天冬酰胺酶。据称加入二价和三价阳离子和多种氨基酸和游离巯基(Elder 等人，2007)，或加入α淀粉酶(de Boer，2006)，或加入氯化钙与磷酸或柠檬酸(Elder等人，2005) —定程度的支持了天冬酰胺酶的活性。
谷氨酰胺酶与天冬酰胺酶相关。谷氨酰胺酶典型的源自乳酸菌，例如存在于鸡肠道微生物丛中的(Thongsanit等人,2008 ;鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus), Weingand-Ziade 等人,2003),或源自酵母(鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii), Iyer和Singhal 2010),或源自海洋真菌(球抱白僵菌(Beauveria bassiana), Sabu等人, 2002)，或仍源自曲霉属霉菌(Prasanth等人， 2009)。
天冬酰胺酶在食品技术中的相关用途很新。在2007年，PreventAse (DSM)酶被引入欧洲市场。PreventAse (DSM)酶是通过重组霉菌-黑曲霉生产的。使用浸泡式补料_分批发酵携带编码米曲霉天冬酰胺酶的基因的遗传修饰的菌株，从相关的霉菌物种——米曲霉(Aspergillus oryzea)获得了被称为Acrylaway (Novozymes)的竞争性天冬酰胺酶。两种曲霉(黑曲霉和米曲霉)都具有较长的安全工业应用的历史，在自然界中广泛分布，且常用于生产食品级酶。
在烘焙应用中，通常在热处理食品(例如，烘焙)前，将天冬酰胺酶与生面团混合， 以消除丙烯酰胺形成。对于油炸马铃薯，可以使用将土豆片浸入天冬酰胺酶的溶液或用天冬酰胺酶的溶液对其进行喷雾。此类处理可以非常有效。在薯片生产中，Corrigan(2008) 报道了相比未处理过的薯片，终产品中的丙烯酰胺水平从1688μ g/kg减少至60μ g/kg。将丙烯酰胺形成降低> 99. 9%被认为是可行的(Elder等人，2004)。
向食品应用的天冬酰胺酶不造成产品安全性问题，因为在包装前步骤中的食品热处理可以热失活天冬酰胺酶。因此，天冬酰胺酶不可能以其活性形式与消费者接触。
担子菌的酶
约1000种可食用真菌中的大部分都属于担子菌纲(Basidiomycota)。担子菌通常被称为高等真菌。担子菌的繁殖是通过形成携带4个减数孢子的柱状细胞(pillar-like cell) ο担子菌的解剖学赋予其命名(拉丁文的Basidium = pillar)。由于其丰富的风味、 高蛋白质、高纤维含量和低热量，担子菌被世界范围的认可。亚洲文化还认为许多担子菌类真菌具有显著的健康保护和治疗活性。
腐生担子菌通常栖居在森林碎屑、森林土壤、落叶层和倒下的树木上。营养细胞在地下球状体中延展形成长纤维状细胞(菌丝)。为了在土壤中最难对付的有机材料—— 三维的木质素网络——生存，腐生担子菌具有极强力的氧化还原酶类。所述氧化还原酶包括木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、多功能过氧化物酶、产生H2O2的氧化酶如葡萄糖氧化酶，以及漆酶类型的酚氧化酶。还可见糖苷酶，例如纤维素酶，帮助降解木材的纤维素部分。
由于落叶树和针叶树不含大量的蛋白质和氨基酸，预期生长在这类特定天然栖息地中的真菌不存在天冬酰胺酶活性。
担子菌中的绒状火菇栽培种也被称为金菇(Enokitake)、金针菇或冬菇(velvet foot)。绒状火菇形成瘦长的白色子实体，在亚洲烹饪中被用作多用途的蘑菇。该蘑菇在传统上被新鲜的或罐装的用于汤、沙拉和其他菜肴。该蘑菇可以冷藏约I周。
发明的目标
本发明的一个目标是提供具有高活性和高操作稳定性的天冬酰胺酶。
本发明的另一个目标是通过使用天冬酰胺酶，降低食品中的丙烯酰胺形成。
发明概述
在本发明的一个方面，本发明涉及可自担子菌获得的天冬酰胺酶。所述担子菌特别是担子菌绒状火菇。
在另一个方面，本发明涉及水解至少一种L-天冬酰胺或L-谷氨酰胺的方法。方法包括用可自担子菌获得的天冬酰胺酶处理包含至少一种L-天冬酰胺或L-谷氨酰胺的物质。
在另一个方面，本发明涉及用于降低包含L-天冬酰胺的物质中的丙烯酰胺形成的方法。方法包括向包含L-天冬酰胺的物质应用可自担子菌获得的天冬酰胺酶。方法之后包括加热包含L-天冬酰胺的物质。
包含至少一种L-天冬酰胺或L-谷氨酰胺的物质可以是食品。
本发明还涉及通过本发明的方法获得的产物。
附图
下文中，参考如下图所示的一些实施方案来描述本发明，其中


图1显示了在浸没培养中生长的绒状火菇胞内形成天冬酰胺酶的时间过程。
图2显示了在浸没培养中生长的绒状火菇胞外形成天冬酰胺酶的时间过程。
图3显示了绒状火菇的天冬酰胺酶的(A)基因组核苷酸序列、(B)编码核苷酸序列和(C)氨基酸序列。前19个氨基酸标注为信号序列。
图4显示了绒状火菇的天冬酰胺酶的盐耐受，所述酶是在作为异源宿主的大肠杆菌中表达的，并作为粗酶被使用。
图5显示了绒状火菇的天冬酰胺酶的pH稳定性，所述酶是在作为异源宿主的大肠杆菌中表达的，并作为粗酶被使用。
图6显示了绒状火菇的天冬酰胺酶的最佳pH。
图7显示了绒状火菇的天冬酰胺酶的温度稳定性，所述酶是在作为异源宿主的大肠杆菌中表达的，并作为粗酶被使用。
图8显示了绒状火菇的天冬酰胺酶的a)活性染色的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)和b)变性PAGE分离。
图9显示了绒状火菇的天冬酰胺酶的最佳温度。
发明详述
为了完全理解本发明及其优点，参考本发明的详细描述和附图。
应该理解，本发明的各个方面仅是制备和使用本发明的具体方式的示例，其在考虑权利要求和下列详细说明时，不作为对本发明范围的限制。
在本发明中，术语天冬酰胺酶用于指能够同时水解L-天冬酰胺和L-谷氨酰胺的酶。
本发明的目的是通过用天冬酰胺酶预定地酶水解丙烯酰胺前体——L-天冬酰胺， 显著降低热处理的食品中的致癌性丙烯酰胺的形成。
在本发明的一个实施方案中，公开了用于生产天冬酰胺酶的方法。天冬酰胺酶具有操作稳定性，获得自担子菌绒状火菇的菌丝体。
绒状火菇的菌株是可通过培养物收藏中心商购的，例如DSMZ (Deutsche Sammlung fiir Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany)或 CBS (Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, The Netherlands)。
使用担子菌绒状火菇的菌丝体为生产和培养的便利提供了极大优势，因为不需要从野外收集子实体。该担子菌绒状火菇物种作为食材广泛使用，因此没有明显的健康风险或安全性问题。
担子菌绒状火菇真菌可以在浸没培养中方便的生长，对培养基添加物仅有最低要求。必需存在有机碳源、氮源 和磷源；这些来源通常由天然混合物提供，例如酵母提取物或葡萄糖加无机氨和磷酸盐。推荐在微生物的所有营养培养基中加入微量和痕量兀素的混合物。优选在浸没培养中进行3至20天担子菌绒状火菇的培养，优选6至15天。在担子菌绒状火菇真菌培养过程中的温度通常是从10至35°C，优选从20至30°C的范围。约4_8的 PH是典型的，约5-7的pH是优选的。此外，低光照条件对于方法而言是典型的。
生物量和天冬酰胺酶的生产方法在温和条件下操作，与现有技术的方法相比是环境友好的。
如图1所示，天冬酰胺酶活性首先积累在胞内，然后分泌到营养培养基中，如图2 所示。
营养培养基有利于方法的操作，和使用本领域已知的技术分离和富集天冬酰胺酶。技术可以是超滤、沉淀或吸附。因此可以获得天冬酰胺酶的无细胞的、浓缩的培养上清液，并将其进一步用于技术性水解。虽然可以通过本领域已知的技术分离天冬酰胺酶，但并非必须分离，本方法中也可以进一步使用所获得的天冬酰胺酶的粗制混合物。
在绒状火菇的浸没培养过程中，约I周后发现胞内天冬酰胺酶活性的峰。在12天后开始向胞外空间分泌，约14天后到达最高峰。
如图8所示，天然聚丙烯酰胺凝胶上的活性染色验证了催化特异性，并在13和 74kDa表现出纯化酶的活性条带，表示存在单体外的寡聚体形式。
如果需要最大的天冬酰胺酶纯度,可以使用枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis) 的重组产物。为了开发重组菌株，需要知道天冬酰胺酶的全长氨基酸序列。图3显示了天冬酰胺酶的全长氨基酸序列，显示具有共计123个氨基酸部分的全长序列，从结构基因的全长372个碱基对序列推断而来。在编码区前有18个碱基对的信号序列。
向底物添加天冬酰胺酶。通过向底物添加天冬酰胺酶，希望天冬酰胺酶与底物接触。这可以包括例如用天冬酰胺酶喷雾、浸泡或包被底物。底物优选的是包含任意一种 L-天冬酰胺或L-谷氨酰胺的食物材料。天冬酰胺酶通常向底物应用的浓度是I至200毫摩尔的总水平，优选10至20毫摩尔，取决于比活。天冬酰胺酶可以作为纯蛋白质添加。可选的，可以根据预期的用途定制天冬酰胺酶，这通过向天冬酰胺酶添加成分，例如乳糖、甘油或白蛋白，以利于配料(dosage)。生产的天冬酰胺酶或定制的天冬酰胺酶可以是酶片剂、 颗粒、稳定的液体或糊状制品的形式。
实施底物水解，获得相比处理前的底物，具有显著较低的天冬酰胺或谷氨酰胺水平的底物。可用于水解的条件是标准的，可以由本领域技术人员方便的确定。
由于天冬酰胺酶活性不受它所存在的化学环境的影响，待处理的底物可以是例如
饮料
可可豆
乳酪
咖啡豆
糖果(confectionery)
甜点·
生面团
调料(dressings)
油炸马铃薯(Frenchfries)
果汁饮料
肉制品
药膳(Medicaldiets)
营养添加物
宠物食品
薯片
调味料
小食
汤。
特别的是，底物是可被人或动物消耗的任何物品。
可以通过测量天冬酰胺减少、天冬氨酸或氨增加，或者在加工食品后，通过测量任何残留的丙烯酰胺的水平，来评估底物中的天冬酰胺的水解程度。
本发明提供的优点是所获得的新型天冬酰胺酶具有对L-天冬酰胺水解而言显著的亲和力和改善的效力。
更令人惊讶的是，天冬酰胺酶对于操作稳定性的优秀技术特性使其能够用于具有升高的温度和离子强度以及不同的PH条件的工艺中(图4-7)。除水外，其他添加剂或其他协同底物(co-substrate)都不是必需的。
新型天冬酰胺酶具有良好的pH稳定性和处于pH 5. 5至9之间的广泛最佳pH，参见图5和6。大部分食品的pH都位于该范围内。
即使在高达55°C的温度下，天冬酰胺酶的操作稳定性也不会减少，参见图7。
如等电聚焦凝胶电泳所确定的，天冬酰胺酶单体和寡聚体的等电点接近5. 2。根据全长序列推出，天冬酰胺酶单体和寡聚体的分子量是12. 8，根据天然聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)推出，聚集形式的分子量为约74，参见图8。
通过ES1-MS分析确定图3所示的天冬酰胺酶的唯一序列。最初发现的肽的最佳同源性被发现是对羧化酶/金属肽酶(E值> 30)、脂肪酶/酯酶/脱乙酰酶(E值> 100)， 和对胃蛋白酶样天冬氨酸/糖苷水解酶出值> 14)。一般非均相的结果和差的E值表示该天冬酰胺酶没有先例，确实是新的。这可用唯一的来源——担子菌物种解释。
通过下列非限制性实施例中的示例，本文进一步描述了本发明。
实施例
在下列实施例中，列出了使用的材料和方法。
材料和方法
培养绒状火菇
在使用前高压灭菌所有的培养基和设备，在整个过程中使用标准的无菌技术。 绒状火菇保持在标准琼脂平板(30. Og L—1葡萄糖单水合物；4. SgL-1天冬酰胺单水合物；1.5g L^1KH2PO4 ；0. 5g L^1MgSO4 ；3. Og L—1 酵母提取物；15. Og L—1 琼脂；1. OmL L—1 痕量金属溶液，其含有 O. 005g L-1CuSO4 · 5H20,0, 08g L-1FeCl3 · 6Η20、0· 09g L^1ZnSO4 · 7Η20,0. 03g L-1MnSO4 · H2O,以及O. 4g T1EDTA (乙二胺四乙酸))上。在灭菌前，用IM NaOH调节培养基的pH至ρΗ6 ο
在IOOmL无菌的标准营养溶液中，使用 Ultra Turrax (Miccra D_9, Art,Miillheim, Germany)均化IOxlOmm琼脂塞子(agar plug)和绒状火燕的菌丝体,制备预培养物。将浸没的培养物保持在24°C和150rpm。培养5天后，将50ml预培养物转移到分别由基本培养基(1. 5g L-1KH2PO4 ；0. 5g L-1MgSO4 ；1. Oml L-1 痕量金属溶液)和 40g L-1 谷蛋白或 IOmM 谷氨酰胺组成的250ml主培养基中。
绒状火菇的天冬酰胺酶制品
培养18天后，过滤培养物，将含有胞外天冬酰胺酶的上清液(200mL)逆向发泡 (reverse-foamed) [I]。使用 10, OOOkDa 的 MWCO (Mi I lipore, Bedford, MA)超滤浓缩存留物，用200mM Tris/HCl pH 7. 5在Superose 6上通过尺寸排阻层析对其进行分离。
活性测试
在37°C分别预热在O.1M磷酸钾pH 7. O中的IOmM L-谷氨酰胺或IOmM L-天冬酰胺。在150 μ L总反应体积中加入50 μ L天然的或10 μ L重组的酶开始所获得的测定，并在10-20min后，通过加入20μ L3% TCA或在95°C加热IOmin终止。进行没有氨基酸的对照实验。用HPLC跟踪产物形成。一单位的酶活性计算为在37°C下，每分钟分别产生I μΜ 谷氨酸或天冬氨酸所需的酶量。
实施HPLC,其中使用 C18Nucleodur Pyramid, 5 μ m, 4mm ID 柱，甲醇作为洗脱剂 A,O.1M醋酸钠加O. 044%三乙胺(用HCl调节pH至6. 5)作为洗脱剂B，邻苯二醛作为衍生化试剂，以及荧光检测仪。
游离蛋白质
根据Lowry方法，使用牛血清白蛋白作为标准，估算水解上清液中的蛋白质浓度。
最佳温度和pH
用培养过程中收获的酶溶液，或在可获得可溶形式的重组蛋白质之后，实施对天冬酰胺酶的最佳温度和PH的确定。37°C下，在pH 4至9的范围内检验最佳pH (O.1M醋酸钠pH 4、5 ；0.1M磷酸钾pH 6、7、8 ；0.1M碳酸钠pH 9)。在最佳pH下，从20至70°C的范围内确定最佳温度。
温度和pH稳定性
为了确定pH稳定性，在40 μ L的上述各缓冲液中，在37°C孵育10 μ L重组酶16h。 加入在O.1M磷酸钾(pH 7)中的IOOyL IOmM谷氨酰胺，在37°C孵育反应20min。进行没有底物的对照实验。在95°C下IOmin终止反应。在如上所述的HPLC分析后，计算所产生的谷氨酸。
为了分析温度稳定性，在40 μ L的O.1M磷酸钾缓冲液(pH 7)中，在各个。C下孵育 10 μ L重组酶Ih。之后，加入在O.1M磷酸钾(pH 7)中的IOOyL IOmM谷氨酰胺，在37°C孵育测定混合物20min。进行没有底物的对照实验。在95°C下IOmin终止反应。在如上所述的HPLC分析后，计算所产生的谷氨酸。
ES1-串联MS分析胰蛋白酶消化肽段
从SDS聚丙烯酰胺凝胶上切出肽酶条带，干燥，和用胰蛋白酶消化。根据标准规程提取和纯化所获得的肽。使用 装备了纳米喷雾离子源和金包被毛细管的QtofII质谱 (Micromass,U. K)进行肽的电喷射离子化(ESI)MS。对于碰撞诱导解离实验，将多电荷的母离子从四极质谱仪选择性的转移到碰撞室中(25-30eV)。通过正交飞行时间质谱仪分离获得的子离子。从ES1-串联MS分析获得的肽质量指纹分析用于在公共蛋白质基本序列数据库中进行跨物种的蛋白质鉴别。
天然PAGE 和变性 SDS-PAGE
在12%聚丙烯酰胺分离凝胶上实施SDS-PAGE分析。通过混合20 μ L天冬酰胺酶溶液和 20 μ L 上样缓冲液(O.1M Tris/HCl (pH 6· 8)，O. 2MDTT，4% SDS，20%甘油，O. 2%溴酚蓝)，并煮沸15min来制备样品。按每块胶20mA电泳后，用银或考马斯亮蓝染色凝胶。对于分子确定，使用250至IOkDa(BioRad, Germany)的标志物蛋白。
在非变性条件下实施天然PAGE。通过与上样缓冲液(0.05MTris/HCL(pH 6.8)、 2%505、10(%甘油、0.1(%溴酚蓝)1 I (v/v)混合制备样品。在8°C下每块胶IOmA电泳后， 在2. 5% Triton X-100中洗涤凝胶2次。染色程序基于谷氨酰胺酶对L-谷氨酰胺脱酰胺作用产生L-谷氨酸。谷氨酸脱氢酶对L-谷氨酸的氧化与四唑.榻■染料对其显色的不可溶性甲 的还原相偶联。谷氨酰胺酶染色溶液含有15mM L-谷氨酰胺、O. SgmL—1牛肝谷氨酸脱氢酶、O.1M磷酸钾pH 7、2mg mL_1NAD>0. 04mg ml/1吩嗪硫酸甲酯和2mg ml/1氮蓝四唑.销·。在37 °C下孵育后，酶活性显示为紫色条带。
等电聚焦
在Multiphor II 系统(Pharmacia LKB, Sweden)上，使用具有 3 至 10 的固定 pH 梯度的 Servalyt Precotes 预制凝胶(Serva, Germany),在 3500V h (2000V, 6mA, 12W)实施IEF聚丙烯酰胺凝胶电泳。使用pi 3. 5至10. 7 (Serva,Germany)的蛋白质测试混合物， 估算天冬酰胺酶的等电点是5。如上所述，对凝胶考马斯蓝、银染或活性染色。
RNA-制备
使用NltcleoSpin RNA 植物试剂盒(Macherey-Nagel, Diiren, Germany),从 500mg 储藏在RNALiater (Invitrogen)中的菌丝体制备 RNA。
cDNA-合成
5μ g 总 RNA 与 25pmol 3’PCR(ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG 30 * T VN)混合， 用DEPC-处理的H2O填补至11 μ I。混合物在70°C孵育5min，然后在冰上冷却2min。加入 4μ I 5χ 反应缓冲液、2 μ I dNTP 混合物(IOmM ea. ),0. 5 μ I RiboLock 和 20pmol SMART II A (AAGCAGTGGTATCMCGCAGAGTACGCGGG)，混合并在 37°C孵育 5min。在加入 200U RevertAidTM H Minus M-MuLV逆转录酶后，在42°C孵育混合物60min。在70°C加热5min进行终止。
通过混合2. 5 μ I IOx Long PCR 缓冲液、2 μ I dNTP 混合物(2. 5mMea.)、25pmol 5，PCR(AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT)、25pmol 3，PCR、lyl DMSOUU Long PCR酶混合物、3 μ I ss cDNA和ddH20至25 μ I，进行第二链合成。
在94°C孵育反应混合物5min，然后进行30个循环的94°C下20s，68°C下6min，在 68°C实施最终的延伸2 0min。
从Fermentas, St. Leon-Rot, Germany 购买酶和试剂。由 EurofinsMWG Operon, Ebersberg, Germany合成寡核苷酸。
序列Fishing
从肽序列推断变性的(Degenerated)引物。通过混合2· 5μ I lOxTrueStart Taq-缓冲液、2 μ I dNTP 混合物(2. 5mM ea.)、2μ I 25mMMgCl2、25pmol 正向引物、25pmol 反向引物、0，8μ1 DMS0.0, 625UTrueStart Taq DNA聚合酶、1μ I ds cDNA和 ddH20至 25 μ 1， 实施PCR。
通过在95°C孵育反应混合物5min，然后进行12个循环的95°C下30s，(72°C _1°C / 循环)下60s和72°C下90s，来实施Touchdown PCR[2]。在60°C退火温度下再进行25个循环。在72°C实施最终的延伸20min。
通过琼脂糖凝胶电泳(1%琼脂糖(Serva, Heidelberg, Germany),在TAE-缓冲液 (40mM Tris、20mM醋酸、ImM EDTA pH 8))中显影，分析PCR。为了检测DNA，在冷却至约50°C 后，向溶液中加入 O. 05%。SYBRSafe (Invitrogen)。
用NucleoSpin Extract II 试剂盒(Macherey-Nagel)从琼脂糖凝胶进行 DNA 提取。
通过混合I μ I载体、I μ I IOx T4DNA连接酶缓冲液、5U T4DNA连接酶、O. 5 μ I 5mM ATP和6. 5 μ I插入DNA，将DNA片段连接到pCR2.1 TA-载体(Invitrogen)中。反应化合物在25°C孵育2小时。
为了转化，将5μ I连接反应物加入到50μ I化学感受态的大肠杆菌 TOPlO(Invitrogen)中，冰上孵育20min，42°C热激45s，重新移至冰上。立即加入500 μ I的 SOC培养基(Invitrogen)。在200rpm和37°C振荡细胞60min,然后放在含有50 μ g/ml氨苄青霉素和20 μ g/ml X-Gal (Roth)的LB琼脂上。在37 °C孵育接种平板过夜。
通过集落PCR实施阳性克隆的选择。反应混合物组成如上所述，但使用引物 M13uni(-21) (TGTAAAACGAC GGC CAGT)和 M13rev(_29) (CAGGAAACAGCTAT GACC)。通过在反应混合物中重悬白色集落材料来加入模板。
反应混合物在95°C孵育5min，再进行40个循环的95°C下30s，55°C下Imin和72°C 下lmin/kb。在72 °C实施最终延伸20min。
用NucleoSpin Plasmid DNA试剂盒(Macherey-Nagel)分离质粒DNA。由 Eurof ins MWG Operon (Ebersberg, Germany)实施测序。
为了使序列完整，具体引物源自已鉴别的天冬酰胺酶DNA片段，且分别与引物 5’ PCR或3’ PCR配对。使用55°C的退火温度和72°C下Imin的延伸步骤，如上所述进行 PCR。
用弓 I 物 FvNase_5’ (ATGAAATCTTTTGCCCTCTTCG)和 FvNase_3’ (TCAAGCAAAGTGATGAAGG)实现扩增全长天冬酰胺酶序列，使用55 °C的退火温度和72°C下Imin的延伸步骤。
为了验证序列，使用基因组DNA纯化试剂盒(Fermentas),从菌丝体制备基因组 DNA。扩增并测序全长天冬酰胺酶序列。
分析DNA和氨基酸序列通过用Signal P 3. O [3]分析进行N端信号序列的鉴别。使用BLAST，通过GenBank 数据库探讨序列同源性[4]。
在大肠杆菌中的异源表达
为了克隆天冬酰胺酶，使用
FvNase_EcoRI(ATAGAATTCATGAAATCTTTTGCCCTCTTC)和 FvNase_BamHI(ATAGGATCC TCAAGCAAAGTCGATGAA)，用侧翼的限制性位点EcoRI和BamHI，通过PCR从质粒DNA扩增基因。消化基因盒，连接到X-Zyme的pCTP2表达载体中，产生表达构建体pCTP2-Aspa。37°C 下，在LB-培养基中生长用pCTP2-Aspa转化的大肠杆菌菌株DH5 α和JM105，至OD6tltol为 O. 7，用O. 5mM IPTG诱导，并进一步培养过夜。将细胞重悬在Tris-缓冲液pH 7. 5中，超声裂解，通过离心去除细胞碎片。用硫酸铵促进天冬酰胺酶的纯化。
枯草芽孢杆菌的重组天冬酰胺酶
细菌分泌蛋白质是ATP依赖性的过程，涉及前蛋白质的易位和前蛋白质在膜外表面上的后续蛋白水解切割，成为成熟的酶。信号序列含有靶向蛋白质至膜用于易位所必需的全部信息。
虽然对枯草芽孢杆菌中的分泌不如对大肠杆菌中的分泌了解清楚，但一般假设其具有相同的机制(Saier, M. H.，Jr.，Werner, P. K.和 Muller, Μ. 1989, Microbiol. Rev 53 333-366 ；Overhoff, B.，Klein, M.，Spies, M.和 Freudl, R.，1991, Mol. Gen. Genet. 228 417-423)。两类分泌蛋白之间的一个差异是其信号肽的长度，在革兰氏阳性菌中倾向于比相应的革兰氏阴性菌的对应物的长多达20个氨基酸。因此，在革兰氏阳性生物(例如枯草芽孢杆菌)中表达异源蛋白质的一般对策涉及匹配靶蛋白与宿主的分泌装置(Mountain， A. , 1989, Bacillus, C. Harwood 编著，Plenum Press, New York, 73-114)。使用上述技术的标准规程是本领域已知的，用于通过枯草芽孢杆菌过表达重组天冬酰胺酶。
实施例1-培养绒状火燕
在使用前高压灭菌所有的培养基和设备，在整个过程中使用标准的无菌技术。绒状火菇种植在标准琼脂平板(30. Og L—1葡萄糖单水合物；4. SgL—1天冬酰胺单水合物；1. 5g L-1 KH2PO4 ；0. 5g L-1 MgSO4 ；3. Og L—1 酵母提取物；15. Og L—1 琼脂；1. OmL L—1 痕量金属溶液，其含有 O. 005g L-1CuSO4 · 5H20、0, 08g L-1 FeCl3 · 6Η20、0· 09g L-1 ZnSO4 · 7Η20、0· 03g L-1MnSO4 · H2O,以及0. 4g Γ1 EDTA)上。在灭菌前，用IM NaOH调节培养基的pH至pH6。
在IOOmL无菌的标准营养溶液中，使用 Ultra Turrax (Miccra D-9, Art, MillIheim, Germany)均化IOxlOmm琼脂塞子(agar plug)和绒状火燕的菌丝体,制备预培养物。将浸没的培养物保持在24°C和150rpm。培养5天后，将50ml预培养物转移到分别由基本培养基(1. 5g L-1KH2PO4 ；0. 5g L-1 MgSO4 ；1. Oml L-1 痕量金属溶液)和 40g L-1 谷蛋白或 IOmM 谷氨酰胺组成的250ml主培养基中。
实施例2-从绒状火菇制备酶
培养18天后，过滤培养物，将含有胞外酶的上清液(200mL)逆向发泡 (reverse-foamed),天冬酰胺酶和另一种蛋白质是留在上清液中的仅有蛋白质。使用超滤 (MWC0 10,000)浓缩剩余的液体,通过Superose6的尺寸排阻层析分离两种蛋白质。
回收了大部分最初存在的水解活性，表明该方法仅通过2步就产生了有效的酶浓缩液。
实施例3-使用天然酶水解L-天冬酰胺
在37°C 预热 100 μ L 在 O.1M Κ2ΗΡ04/ΚΗ2Ρ04 缓冲液(pH 7. O)中的 IOmM 天冬酰胺 5min。加入50 μ L酶溶液开始反应。在热振荡器(thermoshaker)中37°C和400rpm孵育 20min的时间后，通过加入20 μ LTCA终止测定。进行没有底物的对照实验。在OPA-衍生后，用HPLC定量测量天冬氨酸的含量，然后使用样品和对照之间的差异计算酶活性。·
分析学证据指示了底物L-天冬酰胺的快速酶促水解。
实施例4-使用天然酶水解L-谷氨酰胺
在37°C 预热 100 μ L 在 O.1M Κ2ΗΡ04/ΚΗ2Ρ04 缓冲液(pH 7. O)中的 IOmM 谷氨酰胺 5min。加入50 μ L酶溶液开始反应。在热振荡器中37°C和400rpm孵育20min的时间后，通过加入20 μ L TCA(三氯乙酸)终止测定。进行没有底物的对照实验。在OPA-衍生后，用 HPLC定量测量谷氨酸的含量，使用样品和对照之间的差异计算酶活性。
这一分析学证据表示天冬酰胺酶对底物L-谷氨酰胺的有用的副活性。
实施例5-使用重组酶水解L-天冬酰胺
在37°C 预热 140 μ L 在 O.1M Κ2ΗΡ04/ΚΗ2Ρ04 缓冲液(pH 7. O)中的 IOmM 天冬酰胺 5min。加入10 μ L用水稀释200倍的重组酶溶液开始反应。在热振荡器中37°C和400rpm 孵育IOmin的时间后，通过在95°C加热IOmin终止测定。进行没有底物的对照实验。在 OPA-衍生后，用HPLC定量测量天冬氨酸的含量，使用样品和对照之间的差异计算酶活性。 重组天冬酰胺酶对天冬酰胺的活性计算为43. 3kU L'
实施例6-用重组酶水解L-谷氨酰胺
在37°C 预热 140 μ L 在 O.1M Κ2ΗΡ04/ΚΗ2Ρ04 缓冲液(pH 7. O)中的 IOmM 谷氨酰胺 5min。加入用水稀释200倍的10 μ L重组酶溶液开始反应。在热振荡器中37°C和400rpm 孵育IOmin的时间后，通过在95°C加热IOmin终止测定。制备没有底物的空白。在OPA-衍生后，用HPLC定量测量谷氨酸的含量，使用样品和对照之间的差异计算酶活性。重组天冬酰胺酶对谷氨酰胺的活性计算为4. 3kU L—1。
本发明详述如上，应理解详细的说明并非意在限制其发明的范围。下列权利要求中提出了希望专利许可保护的 内容。
权利要求
1.可自担子菌获得的天冬酰胺酶。
2.权利要求1的天冬酰胺酶，其中担子菌是担子菌绒状火燕(Flammulinavelutipes)。
3.具有下述氨基酸序列的天冬酰胺酶MKSFALFVPL IVAAVVNSAV VTFSTGLGCN SVSQTYRGNG NFCADPPGDffSSVGFSEIGG DNRVTVHNQN SCTPASQVGQ GFGPACffNQG ATKLRSAffVACPGQRLAENG TIVDDDGAFI DFA。
4.任一项上述权利要求的天冬酰胺酶，其处于固体、液体或介于固体和液体之间的中间体的形式。
5.任一项上述权利要求的天冬酰胺酶和赋形剂的组合，所述赋形剂选自乳糖、甘油或白蛋白之任一。
6.用于水解至少一种L-天冬酰胺或L-谷氨酰胺的方法，包括 -用权利要求1至5的任一项的天冬酰胺酶处理包含至少一种L-天冬酰胺或L-谷氨酰胺的物质。
7.权利要求6的方法，其中包含至少一种L-天冬酰胺或L-谷氨酰胺的物质是至少一种可被人消耗的产物或可被动物消耗的产物。
8.权利要求6至7的任一项的方法，其中物质选自饮料、可可豆、乳酪、咖啡豆、糖果、甜点、生面团、调料、油炸马铃薯、酒、肉制品、药物添加物、营养添加物、宠物食品、薯片、调味料、小食或汤的至少一种。
9.用于降低包含L-天冬酰胺的食品物质中的丙烯酰胺形成的方法，包括 -向包含L-天冬酰胺的食品物质应用权利要求1至5的任一项的天冬酰胺酶；和 -加热包含L-天冬酰胺的物质。
10.权利要求9的方法，其中加热至至少120°C。
11.权利要求9至10的任一项的方法，其中L-天冬酰胺的来源是至少一种可被人消耗的产物或可被动物消耗的产物。
12.通过权利要求6至11的任一项的方法可获得的产物。
全文摘要
源自真菌担子菌的天冬酰胺酶，特别地担子菌是绒状火菇(Flammulinavelutipes)。用于水解至少一种L-天冬酰胺或L-谷氨酰胺的方法。还描述了用于降低包含L-天冬酰胺的物质中的丙烯酰胺形成的方法。
文档编号C07K14/00GK103003297SQ201180034717
公开日2013年3月27日 申请日期2011年4月6日 优先权日2010年7月14日
发明者P·贝伦茨, S·拉贝, R·G·伯格, D·林克, N·艾泽勒 申请人:雀巢产品技术援助有限公司