凝血因子xiii的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药生物工程领域，尤其涉及一种以人类血液或哺乳动物血液为原料 制备医用凝血因子XIII的方法。
【背景技术】
[0002] 凝血因子XIII(又称纤维蛋白稳定因子、纤维蛋白连接酶、转谷氨酰胺酶)是以酶 原(A2B2四聚体，Mr ? 320KD)形式存在于血浆中的一种糖蛋白，是正常凝血所必需的一种血 浆蛋白酶，被激活后发挥转氨酶的作用，可催化可溶性纤维蛋白单体(sFM)分子间的交联反 应，形成γ链二聚体以及大分子量的α链多聚体，增加血块强度，加速伤口愈合。
[0003] 目前国内外的凝血因子XIII的制备主要从人血浆、酵母细胞中提取，还有从血小 板、胚胎中提取，临床上使用时再经凝血酶催化，在Ca 2+参与作用下，转变成具有活性的如结 构，催化纤维蛋白凝胶进一步共价交联成不溶的血纤维蛋白凝块。
[0004] 凝血因子XIII制品可从人或动物猪血液中提取，我国是畜牧大国，养猪业规模较 大，猪血资源十分丰富，由于生产工艺不够成熟，导致目前我国猪血的利用率很低。从猪血 中提取FXIII既可以充分利用猪血资源，又可以减少因排放而造成的环境污染。FXIII的缺 乏会导致迟发性出血、表面擦伤出血、皮下血肿、组织损伤出血、口腔粘膜和牙龈出血常见， 更为常见的是运动损伤或肌肉注射引起肌肉血肿。此外，FXIII对治疗手术后伤口愈合紊 乱、硬皮病、溃疡性结肠炎、伪膜性结肠炎等很有效。FXIII也是组织粘合剂的重要成分之 〇
[0005] 凝血因子XIII是一种糖蛋白，一般的凝血因子XIII的提取包括六个基本步骤，即 血浆血球分离、病毒灭活、硫酸铵分级沉淀、DEAE-FF层析柱、进行分装和冻干，最后经干热 病毒灭活和钴-60辐照。但是上述工艺存在以下缺陷：
[0006] 生产的过程中三次溶解的时间太长，这个过程中容易导致细菌等微生物繁殖，从 而增加产品中热原等毒素的含量;溶解时间过长也容易造成活性损失，同时延长生产周期， 增加成本;上述工艺制得的产品，纯度不高，活性较低。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题是:提供一种得率高、纯度高且生产周期短的凝血因 子XIII的制备方法。
[0008] 为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为:凝血因子XIII的制备方法，包 括如下步骤：
[0009] 步骤1、向血液中加入抗凝剂后离心分离，取上清抗凝血浆；
[0010]步骤2、向上清抗凝血浆中加入磷酸三丁酯和吐温-80作为病毒灭活剂，并加入助 剂，进行S/D病毒灭活，得灭活后的血浆；
[0011] 步骤3、将步骤2所得灭活后的血浆离心，取清液；
[0012] 步骤4、将步骤3所得清液预冷至0~4°C，加入0~4°C的饱和硫酸铵溶液后，取沉 淀；
[0013] 步骤5、将步骤4所得沉淀用0~4°C的饱和硫酸铵溶液洗涤，将洗涤后的沉淀破碎 并加入0~4°C的一次溶解剂并搅拌，取清液，所述一次溶解剂为氯化钾溶液；
[0014] 步骤6、将步骤5所得清液预冷至0~4°C，加入0~4°C的乙酸体积分数为94 %~ 96 %的乙酸溶液至溶液pH为5.2~6.5后，加入硫酸铵固体至溶液饱和度为15 %~20 %，取 沉淀；
[0015] 步骤7、向步骤6所得沉淀中加入0~4°C的二次溶解剂并搅拌，取清液，所述二次溶 解剂为含有氯化钠的缓冲液，所述缓冲液中的缓冲对为Tris-HCl、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠 和柠檬酸盐-磷酸盐中的任一种；
[0016] 步骤8、将步骤7所得清液水浴加热至53~56°C，维持160~200秒后冷却至0~4°C， 取清液；
[0017] 步骤9、向步骤8所得清液中加入硫酸铵固体至溶液饱和度为35%~40%，取沉淀； [0018]步骤1〇、向步骤9所得沉淀中加入0~4°C的三次溶解剂并搅拌，取清液，所述三次 溶解剂为含有氯化钾的Tr i s-HCl缓冲液；
[0019] 步骤11、将步骤10所得清液梯度洗脱后冷冻干燥，即得凝血因子XIII冻干制品。
[0020] 本发明的有益效果在于:在溶解时加入不同的溶解剂，同时使得沉淀中的凝血因 子XIII溶解充分同时大大缩短溶解时间，减少细菌滋生;提取效率高，每升血浆能提取10毫 克以上的凝血因子XIII;制得的凝血因子XIII冻干制品中，凝血因子XIII纯度在90%以上； 操作简单，生产周期短，在2天时间内即可完成凝血因子XIII的制备；制得的凝血因子XIII 冻干制品的复溶时间短，稳定性好，保存时间长。
【附图说明】
[0021 ]图1为本发明实施例1和实施例2的凝血因子XIII的制备方法的流程图。
【具体实施方式】
[0022]为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附 图予以说明。
[0023] 本发明最关键的构思在于:在病毒灭活时加入助剂，在0~4°C环境下进行凝血因 子XIII的分级沉降、溶解过程，加入不同的溶解剂对沉淀进行分级溶解，提高溶解效率，缩 短生产周期，减少细菌滋生，提高凝血因子XIII得率和纯度。
[0024] 请参照图1，凝血因子XIII的制备方法，包括如下步骤：
[0025] 步骤1、向血液中加入抗凝剂后离心分离，取上清抗凝血浆；
[0026]步骤2、向上清抗凝血浆中加入磷酸三丁酯和吐温-80作为病毒灭活剂，并加入助 剂，进行S/D病毒灭活，得灭活后的血浆；
[0027] 步骤3、将步骤2所得灭活后的血浆离心，取清液；
[0028] 步骤4、将步骤3所得清液预冷至0~4°C，加入0~4°C的饱和硫酸铵溶液后，取沉 淀；
[0029] 步骤5、将步骤4所得沉淀用0~4°C的饱和硫酸铵溶液洗涤，将洗涤后的沉淀破碎 并加入0~4°C的一次溶解剂并搅拌，取清液，所述一次溶解剂为氯化钾溶液；
[0030] 步骤6、将步骤5所得清液预冷至0~4°C，加入0~4°C的乙酸体积分数为94 %~ 96 %的乙酸溶液至溶液pH为5.2~6.5后，加入硫酸铵固体至溶液饱和度为15 %~20 %，取 沉淀；
[0031] 步骤7、向步骤6所得沉淀中加入0~4°C的二次溶解剂并搅拌，取清液，所述二次溶 解剂为含有氯化钠的缓冲液，所述缓冲液中的缓冲对为Tris-HCl、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠 和柠檬酸盐-磷酸盐中的任一种；
[0032] 步骤8、将步骤7所得清液水浴加热至53~56°C，维持160~200秒后冷却至0~4°C， 取清液；
[0033] 步骤9、向步骤8所得清液中加入硫酸铵固体至溶液饱和度为35%~40%，取沉淀； [0034]步骤10、向步骤9所得沉淀中加入0~4°C的三次溶解剂并搅拌，取清液，所述三次 溶解剂为含有氯化钾的Tr i s-HCl缓冲液；
[0035] 步骤11、将步骤10所得清液梯度洗脱后冷冻干燥，即得凝血因子XIII冻干制品。 [0036]所述助剂为氨基酸、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、山梨醇、葡萄酸钠、柠檬酸三钠、EDTA中 的一种或几种，助剂中的氨基酸为谷氨酸、赖氨酸、丙氨酸、组氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、精氨 酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸中的一种或几种，所述助剂中的溶质的浓度均为0.01~1. Omol/ L〇
[0037] 助剂能提高凝血因子XIII制品的质量，在病毒灭活和沉降过程中起到保护凝血因 子XIII的生物学活性的作用。
[0038] 发明人在实际生产实践中发现，由于在S/D病毒灭活后，由于病毒体被灭火剂破 坏，产生了大量变性的蛋白，同时灭活剂对血浆中的各种蛋白也有一定程度的破坏，导致蛋 白质变性，产生各种不溶物，这些不溶物经发明人研究发现，对产品质量，尤其是复溶速度 与产品纯度具有不利影响，因此在灭活后加入离心分离步骤。
[0039]夹杂在沉淀中的S/D灭活剂、杂蛋白等对产品的复溶速度与品质同样有不利影响， 因此采用冷硫酸铵溶液作为洗涤剂，以洗去一次沉淀里的残余的S/D灭活剂和杂蛋白；采用 0~4°C的饱和硫酸铵溶液作为洗涤剂是因为温度过高时，洗涤剂会溶解凝血因子XIII。 [00 40]其中，在上述梯度洗脱过程中，采用新型DEAE Sepharose FF填料，分离效果好。
[0041] 其中，所述血液为无菌采集的猪血液或人血液。其中，所述一次溶解剂中氯化钾的 浓度为〇 · 1~〇 · 2mol/L。
[0042] 其中，所述二次溶解剂中氯化钠的浓度为0.1~0.2mol/L，缓冲对的浓度为0.01~ 0 · 05mol/L，所述二次溶解剂的pH值为7 · 0~7 · 5。
[0043] 其中，所述三次溶解剂的pH值为8.0，三次溶解剂中氯化钾的浓度为0.50mM，三次 溶解剂中Tris-HCL的浓度为10mM。
[0044] 其中，步骤11中进行冷冻干燥前向梯度洗脱后的溶液中加入冻干保护剂，所述冻 干保护剂的溶质选自多羟基碳水化合物、柠檬酸三钠、氯化钠、氨基酸中的一种或几种。
[0045] 优选的，所述冻干保护剂的溶质为多羟基碳水化合物、柠檬酸三钠、氯化钠和氨基 酸;所述冻干保护剂中，多羟基碳水化合物的浓度为〇. 1 %~5 % w/v，氯化钠的浓度为0.1 % ~0.9 % w/v，氨基酸的浓度为0.1 %~5 % w/v。本申请中w/v的单位均为g/mL，如"多羟基碳 水化合物的浓度为〇 . 1 %~5 表示，每100毫升溶液中含有0.1~5克的多羟基碳水化 合物，即多羟基碳水化合物的浓度为1~50g/L。
[0046]其中，所述多羟基碳水化合物选自蔗糖、海藻糖、葡萄糖、甘露醇、