一种从细胞培养液中分离纯化重组人凝血八因子的方法
【专利摘要】本发明公开了一种从细胞培养液中分离纯化重组人凝血八因子的方法，包括下列步骤：去除重组人凝血八因子细胞培养液中的细胞；将去除细胞的培养液超滤浓缩；将超滤浓缩的培养液经阴离子交换层析、免疫亲和层析或凝胶过滤层析中的一项或多项纯化获得纯化的重组人凝血八因子；所述阴离子交换层析、免疫亲和层析及凝胶过滤层析中所采用的平衡缓冲液及洗脱缓冲液中，均含有摩尔浓度为1-100mM的钙离子及摩尔浓度为1-100mM的锌离子。本发明通过在整个层析过程所用的缓冲液中添加钙锌离子的方法，有效解决了八因子的降解问题，使得整个纯化操作能够在常温下进行，大大提高了工作效率，并且还提高了终产品的比活。
【专利说明】—种从细胞培养液中分离纯化重组人凝血八因子的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物工程下游技术，尤其涉及从细胞培养液中分离纯化重组人凝血八因子的方法。
【背景技术】
[0002]凝血八因子，又称为抗血友病因子，在内源性凝血体系中具有十分重要的作用，是激活凝血因子IX的辅助因子。基因重组因子VDI (rFVDI)即重组人凝血八因子是第I个上市的重组凝血因子制品，1992年第一个重组人凝血八因子产品Baxter公司的Recombinate获得FDA批准,后面陆续推出了 Bayer公司的Kogenate FS, Genetics Institute公司的ReFacto, 2003年FDA批准了 Baxter公司第二代产品Avate，2007年SFDA批准了首个国内上市的rF VDI拜科奇。长达20年的临床应用表明，重组人凝血八因子与天然凝血八因子相比具有相似的生化、免疫及药理学特性，能有效纠正血友病患者的出血倾向，具有良好的治疗效果。
[0003]重组人凝血八因子的纯化是八因子制备过程中的难点，主要是八因子稳定性差，容易产生降解，从而失活。由于八因子的不稳定性，早期的第一代重组人凝血八因子产品，Recombinate ,Kogenate FS等利用有血清培养基培养,在纯化中添加人血白蛋白做保护剂，防止八因子降解，第二代产品为了制备出无血清无蛋白的重组八因子产品，改进了部分纯化工艺，很多文献专利报道了在纯化过程中缓冲液添加了氯化钙，氯化钠，组氨酸。也有一些报道添加了基础氨基酸例如赖氨酸或者糖类例如蔗糖等，这些成分的添加都是为了维持无白蛋白保护的八因子的稳定性。美国专利4877608提到了低离子强度，欧洲专利0314095缓冲液使用了高离子强度和组氨酸，美国专利5763401提到了添加蔗糖能保护八因子活性。但是，八因子的纯化在添加了这些添加物后还需要在纯化过程中严格控制低温的环境，才可以更好的维持八因子的稳定性。
[0004]因此，目前重组人凝血八因子的纯化过程都是在低温下进行，而且要求比较快速的处理细胞培养液，为了维持八因子的稳定，一般会在层析分离纯化的缓冲液中添加钙离子等添加物用以保护八因子，防止八因子降解，但是如果八因子在纯化过程中时间比较长(超过4小时)或者温度控制不好(超过10度)，八因子会出现降解条带，而且降解条带很难通过层析的方法除去，所以从细胞培养液开始就维持八因子的稳定性，防止八因子的降解就成为得到合格的重组人凝血八因子产品的关键。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是克服现有技术中的缺陷，提供一种重组人凝血八因子的纯化方法。
[0006]本发明提供了一种从细胞培养液中分离纯化重组人凝血八因子的方法，包括下列步骤:
[0007]I)去除重组人凝血八因子细胞培养液中的细胞；[0008]2)将去除细胞的培养液超滤浓缩；
[0009]3)将超滤浓缩的培养液经阴离子交换层析、免疫亲和层析或凝胶过滤层析中的一项或多项纯化获得纯化的重组人凝血八因子；
[0010]其中，步骤3)所述阴离子交换层析、免疫亲和层析及凝胶过滤层析中所采用的平衡缓冲液，以及步骤3)所述阴离子交换层析和免疫亲和层析的洗脱缓冲液中，均含有摩尔浓度为1-1OOmM的钙离子及摩尔浓度为1-1OOmM的锌离子，钙离子与锌离子的摩尔浓度优选均为2-50mM，更优选均为2-20mM，最优选均为10mM。
[0011]其中，步骤3)在首次层析前，将超滤浓缩的培养液采用首次层析所用的平衡缓冲液以体积比1:2-1:50混合并再次超滤浓缩后，再进行层析。超滤浓缩的培养液与平衡缓冲液的体积比优选1:5-1:50。
[0012]所述步骤I)中，
[0013]去除重组人凝血八因子的细胞培养液中的细胞的方法为现有技术，如微孔过滤、离心去除细胞等，具体如采用0.45微米膜过滤。
[0014]所述步骤2)中，
[0015]可米用截留分子量为10-300KD的超滤膜超滤浓缩，如米用截留分子量为30KD的超滤膜超滤浓缩。
[0016]所述步骤3) 中，
[0017]所述阴离子交换层析所用的层析柱可选自Q Sepharose FF阴离子交换层析柱、DEAE阴离子交换层析柱、Capto Q阴离子交换层析柱中的至少一种。优选采用Q SepharoseFF阴离子交换层析柱和DEAE FF阴离子交换层析柱。
[0018]阴离子交换层析所用平衡缓冲液可由Tris-HCl缓冲液，磷酸盐缓冲液，组氨酸缓冲液，HEPES缓冲液添加钙离子源与锌离子源获得，优选的配方为:含1-1OOmM的钙离子，1-1OOmM的锌离子，5-15mM L-组氨酸，200_400mM NaCl, pH 6.0_8.0的平衡缓冲液，如含1-1OOmM的氯化钙，1-1OOmM的醋酸锌，IOmM L-组氨酸，300mM NaCl，pH 7.0的平衡缓冲液。
[0019]阴离子交换层析所用洗脱缓冲液可为Tris-HCl缓冲液，磷酸盐缓冲液，组氨酸缓冲液，HEPES缓冲液添加钙离子源与锌离子源获得，优选的配方为:含1-1OOmM的钙离子，1-1OOmM的锌离子，5-15mM L-组氨酸，600_800mM NaCl，pH6.0-8.0的洗脱缓冲液，如含l-100mol/L的氯化钙，l-100mol/L的醋酸锌，IOmM L-组氨酸，700mM NaCl, pH7.0的洗脱缓冲液。
[0020]所述阴离子交换层析的其他条件采用常规。
[0021]所述免疫亲和层析所用的层析柱为偶联有凝血八因子抗体的亲和层析柱，此类层析柱可经市售途径获得，如GE公司的八因子亲和(V8 SELECT)层析柱。
[0022]免疫亲和层析所用平衡缓冲液可为Tris-HCl缓冲液，磷酸盐缓冲液，组氨酸缓冲液，HEPES缓冲液添加钙离子源与锌离子源获得，优选的配方为:含1-1OOmM的钙离子，1-1OOmM 的锌离子，5-15mM L-组氨酸，200-400mM NaCl, 0.01-0.03%(w/v
0.01-0.03g/100ml) Tween 80，ρΗ6.0-8.0 的平衡缓冲液，如含 1-1OOmM 的氯化钙，1-1OOmM的醋酸锌，IOmM L-组氨酸，300mM NaCl, 0.02%(w/v 0.02g/100ml) Tween 80，ρΗ7.0 的平衡缓冲液。
[0023]免疫亲和层析所用洗脱缓冲液可为Tris-HCl缓冲液，磷酸盐缓冲液，组氨酸缓冲液，HEPES缓冲液添加钙离子源与锌离子源获得，优选的配方为:含1-1OOmM的钙离子，1-1OOmM 的锌离子，5-15mM L-组氨酸，L 0-2.0M NaCl, 0.01-0.03%(w/V 0.01-0.03g/100ml) Tween 80，40-60%(v/v)乙二醇，ρΗ5.5-7.5 的洗脱缓冲液，如含 1-1OOmM 的氯化钙，1-1OOmM 的醋酸锌，20mM L-组氨酸，1.5M NaCl, 0.02%(w/v
0.02g/100ml) Tween 80，50%(v/v)乙二醇，ρΗ6.5 的洗脱缓冲液。
[0024]所述免疫亲和层析的其他条件采用常规。
[0025]所述凝胶过滤层析所用的层析柱可选自Superdex 200HR, Sephacryl S-300 HR和Sephacryl S-400 HR,优选GE公司的Sephacryl S-300 HR凝胶过滤层析柱。
[0026]凝胶过滤层析析所用平衡缓冲液可为Tris-HCl缓冲液，磷酸盐缓冲液，组氨酸缓冲液，HEPES缓冲液添加钙离子源与锌离子源获得，优选的配方为:含1-1OOmM的钙离子，1-1OOmM 的锌离子，100-200mM NaCl, 1-3%(w/v l_3g/100ml)蔗糖，ρΗ5.8-7.8 的 10_30mM磷酸盐缓冲液，如含1-1OOmM的氯化钙，1-1OOmM的醋酸锌，150mM NaCl, 2%(w/v 2g/100ml)蔗糖，pH6.8的20mM磷酸盐缓冲液。
[0027]所述凝胶过滤层析的其他条件采用常规。
[0028]所述平衡缓冲液及洗脱缓冲液中所含钙离子的钙离子源可选自:氯化钙、硫酸钙，碳酸钙中的至少一种；所述平衡缓冲液及洗脱缓冲液中所含的锌离子的锌离子源可选自:醋酸锌、硫酸锌、碳酸锌中的至少一种。
[0029]优选的，步骤3)将步骤2)获得的超滤浓缩液进行Q Sepharose FF阴离子交换层析并收集洗脱液；将经Q Sepharose FF阴离子交换层析获得的洗脱液进行免疫亲和层析并收集洗脱液；将经免疫亲和层析获得的洗脱液进行DEAE FF阴离子交换层析并收集洗脱液；再将经DEAE FF阴离子交换层析获得的洗脱液进行凝胶过滤层析并收集凝胶过滤主峰，最终获得纯化的重组人凝血八因子。该优选方法可以获得纯度为98%以上的终产品。
[0030]进一步的，本发明纯化重组人凝血八因子的层析步骤前还包括病毒灭活步骤，层析后还包括冻干步骤。[0031]本发明的方法可适用于采用有血清培养基培养或无血清培养基培养的重组人凝血八因子细胞培养液的纯化。细胞表达重组人凝血八因子已是成熟技术，如采用中国仓鼠卵巢细胞CHO细胞，幼鼠肾细胞BHK细胞，239细胞，HEK细胞等细胞株表达重组人凝血八因子，根据工程细胞株的种类不同，可采用各种常用的培养基培养，如DMEM，IMDM, 1640等添加(Tl5%牛血清的培养基，或无血清培养基如，SIGMA公司的SFMII302，HYCL0NE公司的适合CHO细胞的无血清培养基以及invitogen公司的无血清培养基产品进行培养表达。本发明的方法普遍适用于各种细胞表达并胞外分泌重组人凝血八因子的细胞培养液的纯化。
[0032]本发明在纯化过程中添加了钙离子和锌离子，发现它们同时作用能很好的增加八因子的稳定性，保护八因子使得八因子不会降解，因此本发明通过在整个层析过程所用的缓冲液中添加钙锌离子的方法，有效解决了八因子的降解问题，使得整个纯化操作能够在常温下进行，大大提高了工作效率，并且还提高了终产品的比活。这样比添加白蛋白等添加物更经济，有效，常温下纯化制备出合格的重组人凝血八因子使得八因子的制备更加简单，经济。
【专利附图】
【附图说明】[0033]图1，显示为实施例1方法的工艺流程图
[0034]图2，重组人凝血八因子最终产品Western Bloting检测结果
[0035]M代表蛋白质分子量标准，“ + ”是最新的惠氏公司的重组八因子产品Xyntha
【具体实施方式】
[0036]以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的【具体实施方式】加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0037]须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置；所有压力值和范围都是指绝对压力。如无特别说明，本发明所述缓冲液的溶剂均为水。
[0038]此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤。
[0039]当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本【技术领域】技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本【技术领域】的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
[0040]实施例1
[0041]1.试验目的:
[0042]考查二价金属离子尤其是钙离子和锌离子在八因子纯化过程中对八因子稳性的影响。
[0043]实验设计考察了在八因子纯化阶段单独添加钙离子，单独添加锌离子和钙离子锌离子同时添加的条件下八因子的稳定性情况。
[0044]2.主要材料:
[0045]重组人凝血八因子细胞培养液:重组人凝血八因子CHO工程细胞(根据现有技术制备)采用SFMII302培养液(SIGMA公司提供)培养获得。
[0046]Q Sepharose FF离子交换层析柱:美国GE公司
[0047]八因子亲和(V8 SELECT)层析柱:GE公司
[0048]DEAE FF离子交换柱:美国GE公司
[0049]Sephacryl S-300 HR 凝胶过滤层析:GE 公司
[0050]3.实验步骤:具体工艺流程如图1所示
[0051]共采用A、B、C、D四个纯化方案。
[0052]3.1纯化方案A
[0053]a.重组人凝血八因子细胞培养液10L，0.45微米膜过滤后通过30KD的超滤膜超滤浓缩到 1L，然后利用5升第一步Q平衡缓冲液(IOmM L-histidine, 300mM NaCl，pH7.0)置换，最后超滤到I升。[0054]b.Q FF离子交换层析柱预先用Q平衡缓冲液平衡5个柱体积)，步骤a超滤后的溶液常温下直接上Q FF离子交换层析柱，上样后利用IOmM L-histidine, 700mM NaCl, pH7.0洗脱，收集洗脱的样品(即Q柱洗脱液)约300毫升上样八因子亲和(V8 SELECT)层析柱。
[0055]c.亲和层析利用 IOmM L-histidine, 300mM NaCl, 0.02%(w/v) Tween80, pH7.0平衡，300 毫升 Q 柱洗脱液上样后利用 20mM L-histidine, 1.5M NaCl, 0.02%(w/v)Tween80, 50% (v/v) ethylene glycol, pH6.5 洗脱,洗脱收集约 100 毫升准备做下一步 DEAEFF离子交换。
[0056]d.DEAE FF 离子交换柱利用 IOmM L-histidine, 300mM NaCl, ρΗ7.0 平衡，平衡后100毫升亲和洗脱液上样，上样结束后用IOmM L-histidine, 700mM NaCl，pH7.0洗脱收集约
20毫升。
[0057]e.凝胶过滤层析使用GE公司Sephacryl S-300HR纯化,层析柱使用20mM磷酸盐缓冲液PH6.8，150mM NaCl, 2%蔗糖平衡，平衡后20毫升DEAE FF层析洗脱液上样，用同样的缓冲液洗脱，最后收集凝胶过滤主峰约15毫升，此为纯度合格的重组人凝血八因子。
[0058]3.2 纯化方案 B、C、D:
[0059]纯化过程同方案A，不同点在于所有缓冲液中利用不同的方案添加了 2mM氯化钙和2mM醋酸锌，见表1。
[0060]表1重组人凝血八因子在纯化过程中不同金属离子添加方案
[0061]+/-代表氯化钙 和醋酸锌在纯化过程中的添加情况，“ + ”为所有纯化过程中均添加，代表所有纯化过程中均不添加。
[0062]4.结果检验:
[0063]
八因子纯化过程中不同金属离子添加方案2mM氯化钙2mM醋酸锌
~ ~ ~
~ ~
C~+
~ + +
[0064]通过四种实验方案纯化出的重组人凝血八因子进行了活性检测(参考Influenceof Buffer Components Used in Immunoaffinity Chromatography for Purification ofFactor VIII/νοη Willebrand Factor.Thromb.Res.1994，74，347-354 文献记载的方法进行)和 Western Bloting.。
[0065]5.结果
[0066]Western Bloting.结果如图2,活性检测数据见表2。
[0067]表2不同实验方案纯化的重组人凝血八因子活性及比活
[0068]图2显示了不同实验方案八因子的降解情况，可以看到D即同时添加了锌离子和钙
[0069]
【权利要求】
1.一种从细胞培养液中分离纯化重组人凝血八因子的方法，包括下列步骤: 1)去除重组人凝血八因子细胞培养液中的细胞； 2)将去除细胞的培养液超滤浓缩； 3)将超滤浓缩的培养液经阴离子交换层析、免疫亲和层析或凝胶过滤层析中的一项或多项纯化获得纯化的重组人凝血八因子； 其中，步骤3)所述阴离子交换层析、免疫亲和层析及凝胶过滤层析中所采用的平衡缓冲液，以及步骤3)所述阴离子交换层析和免疫亲和层析中所采用的洗脱缓冲液中，均含有摩尔浓度为1-1OOmM的钙离子及摩尔浓度为1-1OOmM的锌离子。
2.如权利要求1所述从细胞培养液中分离纯化重组人凝血八因子的方法，其特征在于，钙离子的摩尔浓度及锌离子的摩尔浓度均为2-50mM。
3.如权利要求1所述从细胞培养液中分离纯化重组人凝血八因子的方法，其特征在于，步骤3)在首次层析前，将超滤浓缩的培养液采用首次层析所用的平衡缓冲液以体积比I=2-1:50混合并再次超滤浓缩后，再进行层析。
4.如权利要求1所述从细胞培养液中分离纯化重组人凝血八因子的方法，其特征在于，所述步骤I)中，采用0.45微米膜过滤去除重组人凝血八因子的细胞培养液中的细胞。
5.如权利要求1所述从细胞培养液中分离纯化重组人凝血八因子的方法，其特征在于，所述步骤2)中，采用截留分子量为10-300KD的超滤膜超滤浓缩。
6.如权利要求1所述从细胞培养液中分离纯化重组人凝血八因子的方法，其特征在于，所述步骤3)中，所述阴离子交换层析所用的层析柱选自Q Sepharose FF阴离子交换层析柱、DEAE阴离子交换层析柱和Capto Q阴离子交换层析柱；所述免疫亲和层析所用的层析柱为偶联有凝血八因子抗体的亲和层析柱；所述凝胶过滤层析所用的层析柱选自Superdex200HR, Sephacryl S-300HR 和 Sephacryl S-400HR。
7.如权利要求1所述从细胞培养液中分离纯化重组人凝血八因子的方法，其特征在于，所述步骤3)中，阴离子交换层析、免疫亲和层析及凝胶过滤层析所用平衡缓冲液及洗脱缓冲液由Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液或HEPES缓冲液添加钙离子源与锌离子源获得。
8.如权利要求1所述从细胞培养液中分离纯化重组人凝血八因子的方法，其特征在于，所述步骤3)中，阴离子交换层析所用平衡缓冲液为:含1-1OOmM的钙离子，1-1OOmM的锌离子，5-15mM L-组氨酸，200_400mM NaCl, pH6.0-8.0的平衡缓冲液；阴离子交换层析所用洗脱缓冲液为:含1-1OOmM的钙离子，1-1OOmM的锌离子，5_15mM L-组氨酸，600-800mMNaCl, pH6.0-8.0的洗脱缓冲液；免疫亲和层析所用平衡缓冲液为:含1-1OOmM的钙离子，1-1OOmM 的锌离子，5-15mM L-组氨酸，200_400mM NaCl, 0.01-0.03%Tween 80，ρΗ6.0-8.0的平衡缓冲液；免疫亲和层析所用洗脱缓冲液为:含1-1OOmM的钙离子，1-1OOmM的锌离子，5-15mM L-组氨酸，1.0-2.0M NaCl, 0.01-0.03%Tween80, 40-60% 乙二醇，pH5.5-7.5 的洗脱缓冲液；凝胶过滤层析析所用平衡缓冲液为:含1-1OOmM的钙离子，1-1OOmM的锌离子，100-200mM NaCl, 1-3% 蔗糖，ρΗ5.8-7.8 的 10_30mM 磷酸盐缓冲液。
9.如权利要求1所述从细胞培养液中分离纯化重组人凝血八因子的方法，其特征在于，所述平衡缓冲液及洗脱缓冲液中所含钙离子的钙离子源选自氯化钙、硫酸钙和碳酸钙；所述平衡缓冲液及洗脱缓冲液中所含的锌离子的锌离子源选自醋酸锌、硫酸锌和碳酸锌。
10.如权利要求1-9任一权利要求所述从细胞培养液中分离纯化重组人凝血八因子的方法，其特征在于，步骤3)的层析纯化方法具体为:将超滤浓缩的培养液进行QSepharoseFF阴离子交换层析并收集洗脱液；将经Q Sepharose FF阴离子交换层析获得的洗脱液进行免疫亲和层析并收集洗脱液；将经免疫亲和层析获得的洗脱液进行DEAE FF阴离子交换层析并收集洗脱液；再将经DEAE FF阴离子交换层析获得的洗脱液进行凝胶过滤层析并收集凝胶过滤主峰， 最终获得纯化的重组人凝血八因子。
【文档编号】C07K1/34GK103539852SQ201210241870
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2012年7月12日 优先权日:2012年7月12日
【发明者】郭颀然, 杨松峰, 许必雄 申请人:上海泰龙生物医药科技有限公司