一种人间充质干细胞培养液上清的生产方法及冻干方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于细胞技术领域，涉及一种干细胞衍生物生物制品及其制备方法，尤其是一种低成本的大量生产人间充质干细胞培养液上清及其冻干的方法及应用。
【背景技术】
[0002]人间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)在培养中分泌碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、人表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)和肝细胞生长因子(HGF)在内的多种促进皮肤细胞再生的生长因子。MSC还分泌大量的可以增加皮肤健康和外观的细胞外间质。将MSC的培养液收集，冻干之后，易于保存，可以和护肤品同时使用以达到养颜护肤的作用。
[0003]人间充质干细胞(MSC)的移植已经在多个领域得到临床应用，包括治疗退行性神经病变，新生儿脑缺血和成人脑中风，以及癌症治疗中的应用，也被应用到矫正皮肤缺陷，但是其培养上清液在养颜护肤中的使用才刚刚开始。
[0004]但是，目前人间充质干细胞培养液上清的生产方法大都非常麻烦，而且生产量较小，上清液中的各种生长因子的量也较小，质量差，可见，现有的方法生产制得的人间充质干细胞培养液上清已经不能完全满足现有的使用。
[0005]成都清科生物科技有限公司申请(专利)号:CN201410238533.3 ;申请日:2014.05.30 ;申请公布号:CN104013644A ;公开公告日:2014.09.03。该申请用于修复皮肤衰老的间充质干细胞条件培养基制剂，其制备方法包括常规条件下培养间充质干细胞至其生长密度为60%?80 %，然后进行换液处理，使用无酚红的DMEM培养基培养，并加入黄芪甲苷，在培养箱中继续诱导培养24h，培养完毕后去除分子量3000以下的细胞因子，进行浓缩，并对培养基中的细胞因子进行检测，并在浓缩后的培养基溶液中加入0.01毫克/毫升?0.6毫克/毫升的还原型谷胱甘肽和0.01%?0.4%的透明质酸。
[0006]上述专利公开文献培养上清液的收集时间比较短，仅24h，能够收集到的生长因子等细胞分泌物的量比较小。故而需要进一步使用超滤方法进行浓缩，加大了工作量和生产成本。
[0007]广州爱菲科生物科技有限公司申请号:201310133711.1 ;申请日:2013-04_17。该发明涉及一种人间充质干细胞培养上清液冻干粉及其制备方法，所述制备方法包括以下步骤:用含有自体血清的间充质干细胞培养基培养传代人间充质干细胞；收集低传代倍数的细胞培养上清液；将所收集的上清液制备成冻干粉。为人间充质干细胞培养上清液的产业化应用奠定了基础。
[0008]该方法使用自体血清培养人间充质干细胞。在临床应用中使用自身血清是出自与免疫排斥反应有关的考虑。但是自身血清的来源极为受限制，而且当人间充质干细胞培养上清液制备是为了外用时，并没有必要使用自身血清。
[0009]通过技术特征对比，本发明专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。
【发明内容】
[0010]本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种大幅度地降低了成本、减少了所需空间、缩短总的培养时间、低成本的大量生产人间充质干细胞培养液上清及其冻干的方法，该生产方法在细胞完全培养基中保留低浓度胎牛血清(3% FBS)，这样与无血清相比，细胞的状况更加健康，可以保证上清液的质量，该培养液上清可以应用在养颜护肤中，该培养液上清冻干制剂再溶后可以和护肤品同时使用可以达到养颜护肤的作用。
[0011]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
[0012]一种人间充质干细胞培养液上清的生产方法，步骤如下:
[0013]⑴脐带取材:
[0014]①高温消毒手术器械和大玻璃皿，同时紫外线消毒超净工作台；
[0015]②严格筛选脐带供者，血液化验排除常见的传染病；
[0016]③在低温冰盒中运送脐带，置脐带于大玻璃皿中，剪成小段，再纵向切开，使用含青链霉素的磷酸盐缓冲盐水清洗脐带，洗净血液；
[0017]④将洗净血液的脐带组织剪成小碎块，即得脐带碎块；
[0018]⑤向两支50 _升呙心管中分别加入5 _升脐带碎块和20晕升2晕克/ _升胶原酶IV，在37°C摇床上消化1.5-2小时；
[0019]⑥每管加入完全培养基到45毫升刻度，在2200转/分离心10分钟；
[0020]其中，完全培养基的组成是DMEM/F12(质量比为1:1)加入DMEM和F12总质量10%的胎牛血清，所述DMEM/F12培养基不含酚红；
[0021]⑦弃除上悬液，加入完全培养基到45毫升，再同样离心一次，之后弃除上悬液；
[0022]⑵人间充质干细胞的接种和在培养瓶中扩增:
[0023]①将每个离心管中分散的细胞连及未完全消化的脐带组织悬浮于40毫升完全培养基中，并加入到四支T75培养瓶中，每培养瓶加10毫升，之后再向每个T75培养瓶中加入20 _升完全培养基；
[0024]②第二天，将组织和液体全部移到另两支T75培养瓶中，原培养瓶中加入30毫升新鲜完全培养基；
[0025]③第四天，全部T75培养瓶置换30毫升完全培养基；
[0026]④此后每3天更换一次完全培养液，直到细胞长满100%面积便进行胰酶消化传代；
[0027]⑤胰酶消化传代:
[0028]使用磷酸盐缓冲盐水清洗T75中培养的细胞2次，质量百分数为0.25%胰酶-EDTA消化，每T75培养瓶使用3-5毫升，37°C消化10分钟；待细胞悬浮后每个T75培养瓶中加入2.5毫升5% FBS培养基，在1000转/分离心10分钟；
[0029]再悬浮于总量40毫升质量百分数为5% FBS培养基，然后进行传代；
[0030]⑥此后每3天换一次5% FBS培养基，培养细胞直到长满90%面积，从此开始收集培养上清液，冻存在_20°C，得人间充质干细胞培养液上清，同时获得培养扩增的细胞；
[0031]⑶人间充质干细胞在Nunc细胞工厂中培养和收集培养液上清:
[0032]①胰酶消化传代到Nunc细胞工厂:PBS清洗步骤⑵⑥中获得的培养扩增的细胞2次，0.25%胰酶-EDTA消化，每T75用3_5毫升，37°C、10分钟，待细胞悬浮后每个T75加入
2.5毫升5% FBS培养基，在1000转/分离心10分钟，再悬浮于5% FBS培养基中，传代到10层Nunc细胞工厂和一个新T75中，或者使用两个四层细胞工厂代替10层Nunc细胞工厂；
[0033]②直到细胞长满60%面积，便将FBS的质量浓度降到3%，FBS浓度降到3%之后每3天收集一次培养液上清，共收集四次便结束培养，即得人间充质干细胞培养液上清，-20 °C冻存备用。
[0034]而且，所述步骤⑴②中传染病包括艾滋病、甲型肝炎、乙型肝炎或丙型肝炎；或者，所述步骤⑴②中剪成小段为剪成3段、每段5厘米长的小段。
[0035]而且，所述步骤⑴③中的磷酸盐缓冲盐水中含有质量百分数为I %的青链霉素。
[0036]而且，所述步骤⑴④中小碎块为2-3毫米的小碎块。
[0037]而且，所述步骤⑵⑤中传代的具体步骤如下:
[0038]按1:4-5比例传代到16-30个T75培养瓶，每一个T75先加20毫升5% FBS培养基，再加2毫升细胞悬液；
[0039]或者，按1:4-5比例传代到8个T175培养瓶，每一个T175培养瓶先加40毫升5% FBS培养基，再加5毫升细胞悬液。
[0040]而且，所述步骤⑶①中10层细胞工厂的完全培养基的总量为1700毫升培养基，T75培养瓶为20毫升，所述四层细胞工每个为650毫升培养基。
[0041]如上所述的人间充质干细胞培养液上清的生产方法制备得到的人间充质干细胞培养液上清的冻干方法，其特征在于:步骤如下:
[0042]⑴取人间充质干细胞培养液上清并分装为3毫升/管；
[0043]⑵打开冷凝水泵，打开LGJ-8YXD冷冻干燥机/冻干机开始降温；
[0044]⑶当搁板组的温度达到-35°C后，将培养液上清标本放进干燥箱；
[0045]⑷当冷凝器内的蒸发器温度达到_50°C以下时，打开空气压缩机；
[0046](5)当干燥箱内压力达到1Pa以下时，开始搁板加热至20°C ;
[0047](6)当温度已达到制品最高许可温度37°C并维持4个小时，直到冻干完毕，关闭所有的开关，即得冻干产品。
[0048]如上所述的人间充质干细胞培养液上清的生产方法制备得到的人间充质干细胞培养液上清在养颜护肤中的应用。
[0049]而且，所述应用的使用方法如下:
[0050]使用时，用3毫升营养液1:1溶解人间充质干细胞培养液上清，营养液成分为烟酰胺、白鲜皮提取物、洋甘菊提取物、金缕梅提取物、复合维生素C和水复配而成，其中烟酰胺的质量浓度在1% -1.5%，白鲜皮提取物的质量浓度在0.5% -1 %，洋甘菊提取物的质量浓度在0.5% -1 %，金缕梅提取物的质量浓度在1% _3%