专利名称：测定细胞培养液及细胞提取物中的nnk及其代谢物的液质联用方法
技术领域：
本发明涉及毒理学及生物化学分析领域，具体为一种分析4_(甲基亚硝基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)的细胞毒性的中性红法及测定细胞培养液及细胞提取物中的NNK及其代谢物的液质联用方法。
背景技术：
烟草特有亚硝胺(Tobacco-SpecificNitrosamines, TSNAs)是一类仅存在于烟草及烟气中的氮亚硝胺类化合物。TSNAs属于器官特异性致癌物质，其作用的主要靶器官是肺部组织。TSNAs可诱导实验动物产生多种癌症，其中NNK和NNN的致癌性最为强烈(施应选.烟叶和烟气中TSNAs的含量分析及其与前体物的关系[D].云南云南师范大学，2006 :15.)，国际癌症研究组织(IARC)将NNK定为一类致癌物(Smokeless tobacco and tobacco-specific nitrosamines. IARC monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans, vol. 89. Lyon (FR) : IARC, 2007.)。生物实验表明 NNK 是大鼠肺癌的强烈致癌剂(Brunnemann K, Hoffmann D. Analytical studies on tobacco-specific N-nitrosamines in tobacco and tobacco smoke[J]. Critical reviews in toxicology, 1991，21(4) : 235-240. )。NNK 和它的主要代谢物 NNAL 是烟气中唯一已知的胰腺癌致癌物(Hecht S S, Chen C B, Ohmori T, Hoffmann D. Comparative carcinogenicity in F344 rats of the tobacco specific nitrosamines, N' -nitrosonornicotine and 4-(N-methyl-N-nitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butano ne [J], Cancer Res, 1980，40: 298-302 ；Hecht S S, Hoffmann D. The relevance of tobacco-specific nitrosamines to human cancer[J]. Cancer Surv.1989, 8: 273-294. )。NNK需要通过代谢活化才能表现其致癌性，对NNK进行体内体外代谢研究可以进一步阐明烟草引发癌症的机制，并为后续癌症预防研究提供技术支持。在有机体一切代谢活动与执行功能的过程中，细胞呈现为一个独立、有序、自动控制性很强的代谢体系(翟中和，王喜忠，丁明孝.细胞生物学[M].北京高等教育出版社， 2000.)，是代谢与功能的基本单位。用细胞进行体外毒理试验具有耗时短并且成本低的特点，测定体外细胞毒性可以大大减少活体动物毒理学测定时的动物数量，并可为确定后续染毒及分离分析试验的剂量提供依据。细胞毒性试验的多种方法中，中性红法检测结果与体内LD5tl的相关性好，结果稳定可靠，灵敏性也较高(王征，张天宝，朱玉平，等.急性毒性体外筛选方法的比较[J].卫生研究，2006，35 (3) J86488;隋海霞，高芄，张立实，等.保健食品快速筛选试验-细胞毒性方法的确定[J].中国食品卫生杂志，2004，16 (6) =485-488 .)。
对于细胞中NNK代谢物的检测，文献报道多采用[5-3H]NNK标记，HPLC法分析 (Hecht S S. Metabolism of 4-(Methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)- 1-butanone by Cultured Monkey Lung Explants[J]. Drug Metabolism and Disposition, 2000, 28(1): 5-9. ；Berhard Schrader, Hirsch-Ernst, Ekkehard scholz, et al. Metabolism of 4-(Methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone in primary cultures of rat alveolar type II cells[J]. Drug Metabolism and Disposition, 2000, 28(2): 180-185. ；Mullett W Μ, Levsen K, Borlak J, et al. Automated in-tube solid-phase microextraction coupled with HPLC for the determination of N—nitrosamines in cell cultures [J], Analytical Chemistry, 2002，74(7) : 1695-1701)。同位素放射性标记试验需具备相应的安全防护措施和条件，每次试验或阶段性试验结束后，都可能有不同程度的放射性污染和放射性废物的出现，要面临去污染处理和放射性废物处理等问题， 近年来应用日益受限。且建立的HPLC法分析时间长，分离效果不佳，峰形质量不高。因此建立一种对所有NNK代谢物都适用且前处理简单快速、选择性好、检测灵敏度高的液质联用方法，具有重要意义。
发明内容
本发明的目的正是针对上述现有技术中所存在的问题而专门研究的一种测定细胞培养液及细胞提取物中的NNK及其代谢物的液质联用方法，该方法特点是通过毒理学与生物化学相结合，利用建立的液质联用方法，分析NNK在细胞中的代谢，具有前处理简单快速、选择性好、检测灵敏度高的优点。本发明的目的是通过以下技术方案来实现的
一种测定细胞培养液及细胞提取物中的NNK及其代谢物的液质联用方法，首先利用中性红法分析NNK的细胞毒性，选定适宜的染毒范围，在选定的染毒范围内对细胞进行NNK的染毒试验，并对染毒后所得的细胞培养液及细胞提取物中的NNK及其代谢物进行液质联用分析。具体包括以下步骤
a.中性红试验取生长状态良好的细胞，消化计数，按适宜密度接种于96孔板，其中第一列作为空白对照，放入培养箱中培养；24 h后染毒，将第三到八列依次加入不同浓度的 NNK染毒液，第二列、第十一列分别加入培养液与十二烷基磺酸钠(SDS)作为阴性与阳性对照，继续培养；24 h后，弃培养液，用PBS漂洗两次，加入已过滤的提前对h温育的中性红培养液培养3 h;弃培养液，用PBS漂洗两次，加入现配的酸乙醇洗脱液(乙醇+水+冰醋酸， 体积比50 49 :1)，置于振荡器上震荡混勻20 min，用酶标仪于MO nm处测定吸光度值；
b.NNK的染毒及细胞培养液样品前处理接种细胞M h后进行NNK染毒处理，继续培养对h后取出培养液。取1 mL培养液置于10 mL离心管，加入内标溶液(内标为三种氘代内标NNK-d4、HPB-d4、NNAL-d3的混合内标溶液)，加入3 mL乙腈，静置1 h沉淀蛋白，10000 rpm离心10 min,取上清液过0. 22 μ m有机相滤膜，取200 μ L滤液于色谱瓶，用流动相混合液(是指15%的流动相A与85%的流动相B的混合液，其中A指水(含10 mM甲酸铵)，B指乙腈)定容至1 mL，混勻，进行LC-MS/MS分析测定；c.NNK的染毒及细胞提取物样品前处理接种细胞M h后进行NNK染毒处理，继续培养对h后取出培养液。用PBS润洗细胞表面三次，取最后一次的润洗液留作监测；加入胰酶进行消化，离心后弃去上清液，得细胞沉淀，加入生理盐水，反复吹打细胞15-30 min，将混合液移至离心管，再向原管中加入生理盐水润洗，洗液一起并入离心管；向管中加入10-15 粒玻璃珠，于涡旋震荡器上涡旋10 s，随即放入冰水中30 s，反复几次，再于14000 rpm，4 °C离心30 min，取上清液即得细胞提取物；取细胞提取物20 μ L，加入60 μ L乙腈沉淀蛋白，静置1 h，10000 rpm离心10 min,取上清液；过MEPS针(指填充吸附微量萃取针)萃取后，进行LC-MS/MS分析测定；
d.样品分析 色谱条件
色谱柱Agilent ZORBAX HILIC Plus 柱 O. IX 100 mm, 3.5 μ m,美国 Agilent 公司)；流动相A 水(含10 mM甲酸铵)，B :乙腈；流速200 μ L/min ；洗脱方式等度15% A+85% B ；进样量2 μ L ；柱温26 °C ； 质谱条件
电离模式电喷雾电离(ESI);扫描模式正离子扫描；检测方式多反应监测(MRM);电喷雾电压(Ion Spray Voltage, IS):5500 V ；离子源温度(TEM):600 °C;雾化气(GS1，N2): 65 psi ；辅助加热气(GS2，N2):60 psi ；气帘气(Curtain gas, CUR, N2) :35 psi ；碰撞气 (Collision gas, CAD, N2):8 psi ；驻留时间(Dwell Time):50 ms ；入口电压 EP(Entrance Potential) 10 V;出口电压 CXP (Collision Cell Exit Potential) :12 V。多反应监测(MRM)条件下各分析物及内标化合物的母离子、子离子以及优化的去簇电压DP和碰撞能量CE值如下表1所示。表1分析物及内标物的MRM参数
Table 1 MRM parameters of the analytes and internal standards
权利要求
1.一种测定细胞培养液及细胞提取物中的NNK及其代谢物的液质联用方法，其特征在于首先利用中性红法分析NNK的细胞毒性，选定适宜的染毒范围，在选定的染毒范围内对细胞进行NNK的染毒试验，并对染毒后所得的细胞培养液及细胞提取物中的NNK及其代谢物进行液质联用分析。
2.根据权利要求1所述的测定细胞培养液及细胞提取物中的NNK及其代谢物的液质联用方法，其特征在于具体包括以下步骤a.中性红试验取生长状态良好的细胞，消化计数，按适宜密度接种于96孔板，其中第一列作为空白对照，放入培养箱中培养；24 h后染毒，将第三到八列依次加入不同浓度的 NNK染毒液，第二列、第十一列分别加入培养液与十二烷基磺酸钠(SDS)作为阴性与阳性对照，继续培养；24 h后，弃培养液，用PBS漂洗两次，加入已过滤的提前对h温育的中性红培养液培养3 h ；弃培养液，用PBS漂洗两次，加入现配的酸乙醇洗脱液，置于振荡器上震荡混勻20 min，用酶标仪于MO nm处测定吸光度值；b.NNK的染毒及细胞培养液样品前处理接种细胞M h后进行NNK染毒处理，继续培养对h后取出培养液；取1 mL培养液置于10 mL离心管，加入内标溶液，加入3 mL乙腈，静置1 h沉淀蛋白， 10000 rpm离心10 min,取上清液过0. 22 μ m有机相滤膜，取200 μ L滤液于色谱瓶，用流动相混合液定容至1 mL，混勻，进行LC-MS/MS分析测定；c.NNK的染毒及细胞提取物样品前处理接种细胞M h后进行NNK染毒处理，继续培养对h后取出培养液；用PBS润洗细胞表面三次，取最后一次的润洗液留作监测；加入胰酶进行消化，离心后弃去上清液，得细胞沉淀，加入生理盐水，反复吹打细胞15-30 min，将混合液移至离心管， 再向原管中加入生理盐水润洗，洗液一起并入离心管；向管中加入10-15粒玻璃珠，于涡旋震荡器上涡旋10 s，随即放入冰水中30 s，反复几次，再于14000 rpm, 4 °C离心30 min，取上清液即得细胞提取物；取细胞提取物20 yL，加入60 PL乙腈沉淀蛋白，静置1 h，10000 rpm离心10 min,取上清液；过MEPS针萃取后，进行LC-MS/MS分析测定；d.样品分析色谱条件色谱柱Agilent ZORBAX HILIC Plus柱；流动相A 水(含10 mM甲酸铵)，B 乙腈；流速200 μ L/min ；洗脱方式等度15% A+85% B ；进样量2 μ L ；柱温26 V ；质谱条件电离模式电喷雾电离(ESI);扫描模式正离子扫描；检测方式多反应监测(MRM);电喷雾电压(Ion Spray Voltage, IS):5500 V ；离子源温度(TEM):600 °C;雾化气(GS1，N2): 65 psi ；辅助加热气(GS2，N2):60 psi ；气帘气(Curtain gas, CUR, N2) :35 psi ；碰撞气 (Collision gas, CAD, N2):8 psi ；驻留时间(Dwell Time):50 ms ；入口电压 EP(Entrance Potential) 10 V;出口电压 CXP (Collision Cell Exit Potential) :12 V。
3.根据权利要求1所述的测定细胞培养液及细胞提取物中的NNK及其代谢物的液质联用方法，其特征在于所使用的色谱柱为美国Agilent公司的Agilent ZORBAX HILIC Plus 柱，型号为 2. IX 100 mm, 3.5 μ m。
4.根据权利要求1所述的测定细胞培养液及细胞提取物中的NNK及其代谢物的液质联用方法，其特征在于步骤a中的酸乙醇洗脱液为乙醇+水+冰醋酸，体积比50 :49 :1。
全文摘要
一种测定细胞培养液及细胞提取物中的NNK及其代谢物的液质联用方法，其特征在于首先利用中性红法分析NNK的细胞毒性，选定适宜的染毒范围，在选定的染毒范围内对细胞进行NNK的染毒试验，并对染毒后所得的细胞培养液及细胞提取物中的NNK及其代谢物进行液质联用分析。该方法特点是通过毒理学与生物化学相结合，利用建立的液质联用方法，分析NNK在细胞中的代谢，具有前处理简单快速、选择性好、检测灵敏度高的优点。
文档编号G01N27/62GK102507766SQ20111031995
公开日2012年6月20日 申请日期2011年10月20日 优先权日2011年10月20日
发明者刘克建, 刘惠民, 尚平平, 张建勋, 李翔, 王娟, 王昇, 赵贝贝 申请人:中国烟草总公司郑州烟草研究院