一种通过测定IVF培养液中β-hCG浓度预测胚胎活力的方法
【专利说明】
所属技术领域
[0001]本发明涉及辅助生殖医学体外受精-胚胎移植(IVF-ET)领域，尤其是在非侵入性胚胎质量评价及挑选部分。
【背景技术】
[0002]经过三十余年的努力，辅助生殖技术(assisted reproduct1n technique, ART)已经取得了多个重大突破，促排卵治疗、体外受精和胚胎培养技术均获得了较完善的发展。然而胚胎种植率还没有得到足够的改善。为获得高妊娠率采用多个胚胎移植及其带来的多胎妊娠率和妊娠期母婴并发症的高发现象依然普遍存在，严重影响了体外受精-胚胎移植治疗(in vitro fertilizat1n-embryo transfer, IVF-ET)的有效率和安全性。因此，在IVF-ET中，如何有效地选择最有活力的胚胎进行移植从而在稳定妊娠率的基础上降低多胎率已成为当今全世界范围ART的热点问题。
[0003]近年来随着生物学标记物检测技术的快速发展，如何从胚胎发育过程中寻找其特定的生物标记，从而客观地评价胚胎发育和种植潜能已成为生殖医学领域基础应用研究的重大挑战。人绒毛膜促性腺激素(human chor1nic gonadotropin, hCG)是一种早期胚胎滋养球细胞和胎盘滋养层合体细胞分泌的，由α亚基及特异性β亚基以非共价键结合的糖蛋白激素。1984年Fishel SB and Edwards RGtn首先采用放射免疫法测定发现人类囊胚培养液中存在微量可测定的β _hCG，其分泌量随囊胚扩张和孵出快速增加，但该方法测定耗时长且有放射污染。2011年Ramu等[2]报道的酶联免疫测定法灵敏度达到0.1OOmlU/ml，但需要大量标本同时测定，且测定花费时间约2天，不能满足IVF临床实验室筛选胚胎方法的要求。因此，如何开发客观、精确、快速和简单、方便、低成本的培养液中hCG检测方法已成为当前亟需解决的困难。
[0004]参考文献:
[0005]1.Fishel SB，Edwards RG，Evans CJ.Human chor1nic gonadotropin secretedby preimplantat1n embryos cultured in vitr0.Science.1984 ；223:816-8.
[0006]2.Sivakumar Ramu, Ph.D，Brian Acac1，M.D.，Mark Adamowiczj et al.Humanchor1nic gonadotropin from day2spent embryo culture media and its relat1nshipto embryo development Fertil&Steril.2011Sep ；96(3):615-617.
【附图说明】
[0007]无
【发明内容】
[0008]为了克服现有的胚胎体外培养液中β-hCG测定方法耗时长、样本需成批非自动化操作、具有放射污染，不能满足IVF临床筛选胚胎技术的要求，本发明提供一种改良的电化学发光免疫法，该方法不仅灵敏度高(0.100mlU/ml)、特异性高(回归系数=0.989)、自动化测定、无污染、重复性及再现性好，而且每份标本测定时间为20分钟左右。经过大样本的回顾性分析证实胚胎培养液β -hCG水平与胚胎发育及种植潜能呈高度正相关，具备作为胚胎生物标记物应用于临床开展选择性胚胎移植的要求。本发明能帮助预测胚胎活力，前瞻性选择具有种植潜力的胚胎移植、在稳定妊娠率的基础上减少移植胚胎数目降低多胎妊娠。
【具体实施方式】
[0009]在此申请专利的方法包括步骤:提供胚胎体外培养后剩余的培养液标本；新鲜或冻存在-80°C中；采用改良电化学发光法测定所述培养液中β_人绒毛膜促性腺激素(β -hCG)水平；基于β -hCG水平预测胚胎发育和种植潜能；选择分泌高水平β -hCG的胚胎进行移植。
[0010]1.胚胎培养
[0011]①能够使用本发明方法评估的人类胚胎可以通过任何现有已知技术的方法产生。
[0012]②在一些实施方案中，胚胎由卵母细胞常规体外受精(IVF)形成的受精卵发育而成。在IVF中，通常将卵母细胞置于精液(浓度为5000-10000条精子/卵细胞)中，使其发生体外受精。受精后16-18小时观察原核情况，将正常受精(双原核)的胚胎置于适用于卵裂期胚胎生长发育的培养液中。受精后第3天观察胚胎情况，再将其转移至适用于囊胚期胚胎生长发育的培养液中。可选择第3天胚胎或囊胚移植到女性子宫腔内。
[0013]③在一些实施方案中，胚胎由单精子卵母细胞浆内注射(ICSI)形成的受精卵发育而成。ICSI常用于男性因素不育(如严重少弱畸精症、无精症)和受精失败患者，在显微镜下将单条精子注入卵母细胞胞浆中。受精后16-18小时观察原核情况，将正常受精(双原核)的胚胎置于适用于卵裂期胚胎生长发育的培养液中。受精后第3天观察胚胎情况，再将其转移至适用于囊胚期胚胎生长发育的培养液中。可选择第3天胚胎或囊胚移植到女性子宫腔内。
[0014]④在一些实施方案中,囊胚由解冻卵裂期胚胎继续培养发育而成。
[0015]⑤用于体外培养培养胚胎的各种培养液可通过商业途径获得，如Quinn’ s SageCleavage and Blastocyst Media，Vitrolife Gl.5and G2.5，Cook Sydney IVF Media，Global IVF media，Medicult ISM1&2。
[0016]⑥胚胎通常在合适的培养皿或试管中培养，其可由玻璃和/或聚苯乙烯合成。
[0017]⑦在一些实施方案中，胚胎在相对固定体积的培养液微滴中培养，并常用矿物油覆盖微滴以减少培养过程中微滴的蒸发和使胚胎与外界环境隔绝。
[0018]⑧在一些实施方案中,每个培养液微滴可培养一个和/或多个胚胎。
[0019]2.β-hCG 测定
[0020]①本发明描述改良电化学发光法的特定应用，胚胎培养液中β -hCG水平可用于预测胚胎种植和临床妊娠的可能性和可行性。
[0021]②在一些实施方案中，培养液标本可在新鲜和/或_8(TC冷冻保存冻融后再进行分析。
[0022]③在一些实施方案中，培养液标本需按比例稀释后再进行分析检测(I: I或1:2)。
[0023]④在一些实施方案中，β -hCG水平通过具体数值体现，胚胎发育和种植潜能用β -hCG某一阈值进行评估。
[0024]⑤在一些实施方案中，需用未培养过胚胎的同批号培养液(添加和未添加蛋白或蛋白类似物)进行空白对照以及质量控制。
[0025]⑥在一些实施方案中，可结合培养液β-hCG水平和胚胎的形态学评分挑选移植胚胎。
[0026]⑦用于改良电化学发光免疫法的各种设备、试剂及耗材可通过商业途径获得，如Hoffmann-La Roche Ltd。
[0027]胚胎移植
[0028]①在一些实施方案中，为了避免多胎妊娠，移植到子宫腔内的胚胎数目可以受到限制。
[0029]②在一些实施方案中，移植胚胎可以是新鲜、冻融胚胎或冻融后卵裂期胚胎继续培养的囊胚。
[0030]3.妊娠结局
[0031 ] ①妊娠结局作为评估胚胎种植潜能的标志。
[0032]②妊娠可由已知的现有技术进行评估。如移植胚胎两周后，通过测定血液或尿液中hCG判断生化妊娠的可能。移植胚胎后5-6周，通过超声下观察孕囊、胚芽和胎心搏动来确定是否临床妊娠。
[0033]③在一些实施方案中，妊娠结局的判读可延长至胎儿某个阶段的发育，如孕早期(孕12周前)、孕中期(孕13周至孕27周)及孕晚期(孕28周后)的胎儿情况。
[0034]④在一些实施方案中，结局可追踪至新生儿出生情况。
【主权项】
1.一种方法，包括以下步骤: 提供胚胎体外培养液； 新鲜或冻存在-80°C中； 测定所述培养液标本中β_人绒毛膜促性腺激素(β-hCG)； 基于培养液β -hCG水平评估胚胎发育和种植潜能。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述胚胎是由卵母细胞常规体外受精(IVF)形成的受精卵发育而成。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述胚胎是由单精子卵母细胞浆内注射(ICSI)形成的受精卵发育而成。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述胚胎是经胚胎活检行植入前遗传诊断后发育??? 。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述胚胎是人类胚胎。6.根据权利要求5所述的方法，包括移植所述胚胎到人类子宫腔内。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述胚胎包括卵裂期和囊胚阶段被移植。8.根据权利要求6所述的方法，其中所述种植潜能判定标准包括生化妊娠和临床妊娠。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述早期妊娠包括所属胚胎发育到孕12周。10.根据权利要求8所述的方法，其中所述中期妊娠包括所属胚胎发育到孕13-27周。11.根据权利要求8所述的方法，其中所述晚期妊娠包括所属胚胎发育到孕28-42周。12.根据权利要求1所述的方法，其中所述测定步骤包括:对所述培养液标本进行改良电化学发光免疫法进行测定。
【专利摘要】一种通过检测人胚胎体外培养液中β-hCG水平预测胚胎发育和种植潜能的方法，包括步骤：提供胚胎体外培养后剩余的培养液标本；新鲜或冻存在-80℃中；采用改良电化学发光法测定所述培养液中β-人绒毛膜促性腺激素(β-hCG)水平；基于β-hCG水平预测胚胎发育和种植潜能；选择分泌高水平β-hCG的胚胎进行移植。
【IPC分类】G01N33/76
【公开号】CN105203776
【申请号】CN201410227658
【发明人】李洁, 陈晓燕, 庄广伦, 姜傥, 张式鸿
【申请人】李洁
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2014年5月26日