一种小型角毛藻浓缩培养液及培养小型角毛藻的培养方法
【专利说明】
[0001]技术领域本发明属于水产养殖领域，尤其涉及一种小型角毛藻浓缩培养液制备方法和高效培养技术。
【背景技术】
[0002]小型角毛藻Chaetoceros minutissismus是一种小型海洋浮游娃藻，隶属娃藻门，中心纲，盒形藻目，角毛藻科，角毛藻属。细胞小，壁薄，大多单个细胞，也有2-3个细胞连成群体。壳面椭圆形至圆形，中央略凸起，少数平坦。壳环面成长方形至四角形，细胞长4.6_9.2微米，宽3.45_4.6微米，冗环市不明显。角毛细而长，末?而尖，自细胞四角生出，几乎与纵轴平行，长20.7-34.5微米。两端的角毛以细胞体为中心略呈“S”形。色素体一个，片状，黄褐色。培养过程中细胞常变形。变形的细胞拉长，角毛缩短或一个壳面的角毛完全消失。变形后藻体比正常的大。正常情况下，小型角毛藻培养液呈金黄色，无沉淀，培养密度可达33万个/ml，适宜盐度范围26-35%。，适温5_30°C，生长率随水温升高而提高，超过30°C下降，最适温度30°C，最适光照10000-150001ux。适宜P H6.4-9.5，最适8.0-8.9。二分裂繁殖，环境不良时可形成休眠孢子，也能形成复大孢子。属广温、广盐藻类，水温20-30°C、盐度30%。时生长最快。与其它单胞藻如球等鞭金藻、湛江叉鞭金藻、扁藻、三角褐指藻相比，该藻繁殖快，易培养，耐高温，营养价值高，是对虾、海参、文蛤、牡蛎、鲍鱼、魁蚶、海胆等海珍品优质育苗饵料。
[0003]关于微藻培养液，传统做法是现用现配，用多少配多少，缺点是操作麻烦，工作量大，特别是一些微量成分和元素，用量极少，称量麻烦，误差大，且培养液不便运输和商品化、市场化运作，不适应现代海洋微藻大规模、集约化、工厂化生产的趋势。目前，小型角毛藻规模化培养存在的主要问题是藻细胞生长缓慢、倍增时间长。过去杨彦豪发明了一种牟氏角毛藻的培养基配方及全人工快速培养方法(申请号CN201310420414)。培养基配方包括尿素0.1-0.3g/L，碳酸氢钠0.05-0.lg/L，硅酸钠水结晶0.1-0.5g/L，磷酸二氢钾0.01-0.02g/L，EDTA 3_5g/L，VBJ-Smg/L, VB121-3 μ g/L，配方溶剂为海水；培养方法为对培养罐、海水消毒后，以海水为溶剂按照以上配方配培养基，将接藻种接入装有培养基的培养罐中，密封后培养，培养时进行三基色灯光光照并充入经过孔径小于0.1 ym空气滤芯过滤的空气，培养3-5天后采收。该发明培养基配方营养均衡、成本低，培养方法使角毛藻快速生长，过程操作简单，但是培养罐容积小，一次只能培养少量藻液，很难在生产中推广应用，且购置培养罐投资大，技术要求高，普通工人难以掌握。杨海麟发明了一种自养产油微藻的高密度培养工艺(申请号CN201010509643)，采用分割法与二步法相耦合的发酵方法，以火电厂排放的CO2废气为碳源，以过滤除杂菌或杂藻后的市政污水作为培养基，高密度培养产油微藻，微藻选自小球藻、微拟球藻、布朗葡萄藻、纤细角毛藻、海绿球藻、球等鞭金藻、新月菱形藻、三角褐指藻、杜氏藻和菱形藻的一种或几种，该发明能实现氮、磷及CO2高去除效率且藻浓度、油脂及蛋白含量高，达到保护环境和生产生物资源双重效果，成本低，无污染，综合效益高，但该法工艺流程长，操作麻烦，易污染，效率低下。
[0004]为了克服传统技术的不足，本发明公开了一种小型角毛藻浓缩培养液制备方法和高效培养技术。本发明的技术优势表现在:I)摒弃了传统培养液现用现配的做法，配制小型角毛藻浓缩培养液，使用方便，工作量小，储存、运输方便，便于培养液的工厂化、标准化、市场化、商品化、专业化生产，微量成分和元素定量准确，误差小，且对传统使用的m营养盐配方进行了优化，补充了鸡粪浸出液，NaHCO3，人尿，Na2S13，过磷酸钙，土壤浸出液，海泥抽取液，MgSO4, Ca(NO3)2, CaCl2, CH3COONa, CH3CH2COONa,吲哚乙酸等成分，成分更加科学、合理、均衡，有利于微藻快速生长且消毒彻底，干净卫生，不易污染；2)使用塑料纯净水桶养殖小型角毛藻，操作灵活，不易污染，洗刷方便，不易划破和碰碎，成本低，产量高；3)尊重小型角毛藻的生长规律，根据藻类不同生长阶段对环境条件的特定要求，在培养的早、中、晚期提供不同的光照时间、强度和温度，在早期光照时间较短，强度较小，避免强光对藻细胞造成光伤害，晚期提供较强的光照强度和时间及较高的温度，有利于细胞中EPA、DHA等高不饱和脂肪酸大量积累；且在培养的中后期补充营养盐，促进角毛藻的持续、快速生长；小型角毛藻产量能提高120% ;4)采用三个塑料桶串联养殖，通入的气体得到三次利用，节约了能量和资源。
【发明内容】
[0005]为了克服目前技术的不足，本发明提供了一种小型角毛藻浓缩培养液及培养小型角毛藻的培养方法，具体方法如下:
[0006]步骤I小型角毛藻浓缩培养液的制备
[0007]培养液成分配方:鸡粪浸出液I份，NaHCO30.6份，人尿0.7份，Na2S130.02份，f/2微量元素溶液0.8份，f/2维生素溶液0.8份，过磷酸钙0.1份，土壤浸出液0.6份，海泥抽取液 0.8 份，MgS04.7H20 0.2 份，Ca(NO3)20.3 份，CaCl2.2H20 0.5 份，CH3COONa 0.05 份，CH3CH2COONa 0.1份，吲哚乙酸0.001份，煮沸冷却海水100份；装入三角烧瓶，放在摇床上摇匀15分钟，浓缩培养液制备完成；其中f/2微量元素溶液配方(按配制1000毫升溶液计):ZnS04.4H20 23 毫克，MnCl2.4H20 178 毫克，CuSO4.5H20 10 毫克，FeC6H5O7.5H20 3.9克，Na2MoO4.2H20 7.3 毫克，CoCl2.6H20 12 毫克，Na2EDTA 4.35 克，蒸馏水 1000 毫升；f/2维生素溶液配方(按配制1000毫升溶液计):维生素B120.5毫克，维生素B110毫克，维生素H 0.5毫克，蒸饱水1000毫升。
[0008]步骤2小型角毛藻高效培养方法
[0009]取三个20升的带把的塑料纯净水桶(市场有售)，分别加入步骤I所述培养液1000毫升，然后加入9000毫升煮沸冷却的普通海水，摇匀；选生长旺盛、无污染、处于指数生长期的小型角毛藻藻种接种，接种密度4万个细胞/毫升藻液，轻轻摇匀3分钟。每个纯净水桶瓶口插入两根玻璃管，管的直径为8毫米，一根为充气管，另一根为排气管，第2个桶的充气管与第一个桶的排气管相连，第3个桶的充气管与第2个桶的排气管相连，这样充入的气体依次经过三个塑料桶，可得到3次利用。第一个桶的充气管上端连接空气压缩机，另一端插入到藻液底部，充入混合气体，气体成分=空气99% +纯CO20.5%-j^一氧化氮0.3%+氨气0.2%，每天24小时不间断充气，气量不宜太大，以藻细胞浮起不下沉即可；将这3个塑料桶放入微藻培养室中培养，室内空调控温，日光灯管照明，以打开灯管的数量多少来控制光照强度，连续培养9天，前3天调节温度至25°C，光照强度60001uX，光暗周期=6h/L+6h/D，即提供间歇光，6小时连续光照，6小时连续黑暗，如此循环；第4-6天，调节温度至26°C，光照强度90001ux，每天提供15小时连续光照，然后9小时连续黑暗，如此循环，至第5天，每个瓶子补加步骤I所述的浓缩培养液50毫升，第7-9天，调节温度至28°C，光照强度120001uX，每天24小时连续光照，没有黑暗，第7天，每个桶补加蒸馏水250毫升，至第8天，每个桶补加步骤I所述的浓缩培养液30毫升，到第9天，小型角毛藻细胞密度可达75万/晕升藻液，培养完毕。
[0010]有益结果
[0011]关于微藻培养液，传统做法是现用现配，用多少配多少，操作麻烦，工作量大，特别是一些微量成分和元素，用量极少，称量麻烦，误差大，且不便运输和商品化、市场化运作。为了克服传统技术的不足，本发明公开了一种小型角毛藻浓缩培养液制备方法和高效培养技术。本技术优势表现在:1)摒弃了传统培养液现用现配的做法，配制小型角毛藻浓缩培养液，使用方便，工作量小，储存、运输方便，便于培养液的工厂化、标准化、市场化、商品化、专业化生产，微量成分和元素定量准确，误差小，且对传统使用的f/2营养盐配方进行了优化，成分更加科学、合理、均衡，有利于微藻快速生长；2)使用塑料纯净水桶养殖小型角毛藻，透光性好，操作灵活，不易污染，洗刷方便，不易划破和碰碎，成本低，产量高；3)尊重小型角毛藻的生长规律，根据藻类不同生长阶段对环境条件的特定要求，在培养的早、中、晚期提供适宜的光照时间、强度和温度，有利于细胞中EPA、DHA等高不饱和脂肪酸大量积累；且在培养中后期补充营养盐，促进角毛藻持续、快速生长；小型角毛藻产量能提高120%;4)采用三个塑料桶串联养殖，通入的气体得到三次利用，节约了能量和资源。
【附图说明】
[0012]图1为小型角毛藻形态；
[0013]图2为小型角毛藻高效培养方法，其中附图标记为:1充气管，2排气管；箭头所指为气体走向。
【具体实施方式】
[0014]一种小型角毛藻浓缩培养液及培养小型角毛藻的培养方法，具体方法如下:
[0015]步骤I小型角毛藻浓缩培养液的制备