一种重组Taq DNA聚合酶及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及基因工程【技术领域】，具体是一种制备水生栖热菌（Thermusaquaticus)TaqDNA聚合酶基因重组表达酶的方法。该基因核苷酸序列及编码蛋白质的氨基酸序列分别为SEQIDNO：1和SEQIDNO：2。本发明通过基因克隆技术克隆出基因序列，构建原核表达载体，利用已构建的TaqDNA聚合酶基因的重组菌株，利用LB培养液进行悬浮，37℃培养4.5小时后，加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导16-20小时，离心收集菌体后使用2-4mg/ml溶菌酶解离得到蛋白液，通过层析柱和透析袋过滤，得到高纯度活性蛋白TaqDNA聚合酶。与现有技术相比，本发明生产工艺稳定性好，得到的TaqDNA聚合酶活力高，可有效地保证产品产量和纯度，用于基因PCR扩增效果良好。
【专利说明】—种重组Taq DNA聚合酶及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程【技术领域】，具体涉及一种制备重组Taq DNA聚合酶的方法。【背景技术】
[0002]1985年,美国Cetus公司发明了具有划时代意义的聚合酶链式反应(polymerasechain reaction, PCR)，是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的方法，即双链DNA在高温下变性解链成单链，在DNA聚合酶、dNTP、特异引物的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。 [0003]原始菌YT-1 (Thermus aquatjcus)具有天然DNA聚合酶，但其Taq DNA聚合酶含量低，从其培养物纯化酶需要进行选择性沉淀和离子交换色谱分离，难以满足对Taq DNA聚合酶的需求。因此，市售的Taq DNA聚合酶大都是基因工程产品，可有效地提高其产率和分离效率。
[0004]虽然Taq DNA聚合酶己经商品化生产多年，但为了提高该蛋白在大肠杆菌中的表达量，简化纯化工艺的尝试一直没有停止。Pluthme Fred利用Taq DNA聚合酶的热稳定性，提出冻融法去除杂蛋白等大分子，所制备的酶可用于PCR和测序反应；孙亮先等利用该酶的热稳定性，经两轮_70°C深度冷冻和75°C水浴，使细菌裂解释放内容物，高速离心除去冻融变性的细胞碎片及核酸蛋白的复合物以达到快速纯化Taq DNA聚合酶的目的，PCR扩增反应表明所制备的Taq DNA聚合酶的活力、敏感性、特异性均达到试验要求。包永明等在用IPTG诱导目的蛋白表达后，采用聚乙烯亚胺沉淀Taq DNA聚合酶，离子交换柱Bio-Rex-70分离纯化，完成Taq DNA聚合酶基因的超表达；赵美蓉等将含有Taq DNA聚合酶基因的E.coli经发酵，细胞培养液经破壁裂解，粗蛋白抽提经Sephaeryl-s-100,CM-Sephadex C50柱层析等纯化步骤，获得了重组Taq DNA聚合酶；汪靖超等利用热变性、亲和层析、阳离子交换层析获得了电泳纯的重组Taq DNA聚合酶；何钢等尝试对TaqDNA聚合酶的制备技术进行整体优化，以插入重组Taq DNA聚合酶基因的Pet_24a表达质粒转化大肠杆菌菌株，以2mmol/L的IPTG诱导8小时，可获得较高的Taq DNA聚合酶表达效率。
【发明内容】
[0005]针对目前现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种重组Taq DNA聚合酶及其制备方法，该制备方法可以得到高纯度Taq DNA聚合酶。利用本发明建立的方法，可从500ml菌液中纯化到约3.5ml Taq DNA聚合酶液，酶活达到16.1Mful0
[0006]本发明的一个目的是提供一种重组Taq DNA聚合酶，其蛋白氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。
[0007]本发明的另一个目的是提供一种编码所述Taq DNA聚合酶的基因，其核苷酸序列如 SEQ ID NO:1 所示。
[0008]本发明的另一个目的是提供一种制备重组Taq DNA聚合酶的方法，具体步骤如下:
(1)克隆SEQID NO:1所示的核苷酸序列；
(2)将步骤(1)所得的核苷酸片段和质粒pET32a进行连接，构建重组质粒pET32a_Taq ；
(3)将重组质粒pET32a_Taq转化入大肠杆菌感受态细胞疋coliBL21中，获得表达菌
株;
(4)表达菌株利用LB培养液进行悬浮培养，37°C培养4.5小时后，加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导16-20小时后；解离菌体，过滤；获得所述重组Taq DNA聚合酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0009]步骤(1)中,所述核苷酸序列是从水生栖热菌中分离出来的Taq DNA聚合酶基因，所述基因编码蛋白可用于制备重组Taq DNA聚合酶。所述基因的核苷酸序列是如SEQ ID NO:1所示，所述基因编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0010]进一步地，在步骤(4)中，所述解离菌体为采用溶菌酶解离菌体；所述过滤为以层析柱和透析袋连续过滤。
[0011]在本发明更进一步的实施方案中，所述溶菌酶的浓度为4mg/ml ;所述层析柱为Bio-Rex 70的离子交换柱树脂；
本发明是在已构建的重组Taq DNA聚合酶基因表达载体的基础上，进行表达体系的优化，提高其Taq DNA聚合酶表达和纯化效率，以获得稳定、高活力的Taq DNA聚合酶。本发明通过基因克隆的方法，从水生栖热菌中克隆到了一个Taq DNA聚合酶基因。通过制备重组Taq DNA聚合酶的方法，重组菌株诱导表达制备出高活力Taq DNA聚合酶，酶活达到16.1Mful0
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1为本发明纯化的Taq DNA聚合酶蛋白质电泳图(1-10为收集的Taq DNA聚合酶；11为市售Taq DNA聚合酶，作为阳性对照；M为标准蛋白质分子量)。
[0013]图2为本发明制备的Taq DNA聚合酶进行PCR检测酶活性电泳图(1_4泳道为本发明的提取制备的Taq DNA聚合酶对模板DNA的PCR反应，分别稀释40倍，30倍，20倍，10倍；5-7泳道为市售Taq DNA聚合酶(5U/ul)对模板DNA的PCR反应，分别稀释8倍，7倍，6倍，5倍；M为标准DNA分子量)。
[0014]图3为本发明制备的Taq DNA聚合酶和商售Taq DNA聚合酶进行PCR检测比较酶活性电泳图(1-4泳道为商售Taq DNA聚合酶不同批次对模板DNA的PCR反应；5_8泳道为本发明提取制备的不同批次Taq DNA聚合酶对模板DNA的PCR反应；M为标准DNA分子量)。
【具体实施方式】
[0015]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，分子克隆实验指南(Sambrook J, et al.2008.Molecular Cloning: A LaboratoryManual, 3rd Ed.)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
[0016]实施例1:基因全长编码区的克隆与分析采用市售的细菌基因组DNA提取试剂盒法提取水生栖热菌(Thermusaquaticus)总DNA，采用Touchdown PCR技术和普通PCR技术进行Taq DNA聚合酶基因的全长序列扩增，扩增引物包括 2 组(5，-tatatgagggggatgctgccc-3，和 5，-tcactccttggcggagagc-3，)。PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳检测后，在紫外灯下切割含有目的条带的胶块，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段，于_20°C保存。回收的目的片段，于16°C金属浴过夜连接至克隆载体PMD19-T (宝生物工程有限公司，TaKaRa)，并转化到大肠杆菌感受态细胞万.ToplO (北京天根生化科技有限公司)中，涂布于含有lOOmg/mL Amp的LB固体培养基上，37°C过夜培养，经过IPTG/X-gal蓝白斑筛选后，挑取4_10个阳性克隆进行测序。将测序结果通过序列比对，分离到了一个Taq DNA聚合酶基因。Taq DNA聚合酶基因序列全长为2499bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码832个氨基酸，以ATG为起始密码子，TGA为终止密码子。Taq DNA聚合酶基因PCR回收产物和pET32a质粒(宝生物工程有限公司，TaKaRa)进行EcoRI和NotI双酶切，在37°C金属浴3_4h后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测，使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收。将目的片段Taq DNA聚合酶基因和质粒pET32a进行连接，16°C过夜，构建好的重组质粒命名为pET32a_Taq。转化入大肠杆菌感受态细胞疋coliBL21 (北京天根生化科技有限公司)中，获得表达菌株，命名为Taq DNA聚合酶菌株。
[0017]实施例2:重组Taq DNA聚合酶菌株的培养及诱导
配制LB液体摇瓶(500 ml的LB液体培养基，分装在2个500 ml的三角瓶中，即每瓶装250 ml，灭菌后待用)。取出Taq DNA聚合酶 菌种，接种在4 ml的LB + Amp (100 Ug/ml)液体培养基中，37°C培养16-20小时。每个三角瓶装250 ml的LB液体培养基，加入Amp (抗生素的终浓度为100 yg/ml)，并用1.25 ml的培养的菌种接种；37°C培养4.5小时。
[0018]加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导，在37°C继续培养16-20小时。
[0019]实施例3:重组Taq DNA聚合酶纯化器具准备
层析柱选用Bio-Rex 70的离子交换柱树脂(干粉的大小是mesh size 100-200。溶胀后的结合能力为5-10 mg蛋白质/ml)。称取7g的Bio-Rex 70的干树脂,放在小烧杯中，用dd H20洗，去掉漂浮的小颗粒，室温溶胀2小时，期间换几次dd H2O;用含50 mM KCl的溶液C预平衡，待用；用含50 mM KCl的溶液C平衡好的树脂。装好树脂后再用6_10倍柱床体积的含50 mM KCl的溶液C平衡柱子。检查进入柱子和流出柱子的溶液C的pH值不变。
[0020]实施例4:蛋白质提取
4°C,4000 rpm，离心20分钟收集菌体；重悬在30 ml的溶液A中，冲洗收集的菌体；4°C,8000 rpm，离心10分钟收集菌体；重悬在20 ml溶液A中，混匀。加入80 mg的溶菌酶，使终浓度达到4 mg/ml ;在室温(25°C)下保持15分钟；加入20 ml的溶液B，75°C水浴保温I小时，期间晃动几次；4°C，10000 rpm,离心20分钟，弃沉淀，收集收集上清液；磁力搅拌器搅拌，在上清液中逐滴加入5% PEI，使终浓度达到0.15% (体积);室温下(25°C)继续搅拌10分钟；4°C，10000 rpm，离心15分钟，收集沉淀；用12 ml的含25 mM KCl的溶液C重悬，并洗涤沉淀；4°C，8000 rpm，离心15分钟，收集沉淀；用12 ml的含25 mM KCl的溶液C重悬，并洗涤沉淀；4°C，5000 rpm,离心10分钟，收集上清液，测量收集上清液的体积；加入2倍体积的不含KCl的溶液C，使收集上清液的最终KCl的浓度达到50mM。
[0021]实施例5:蛋白质纯化及检测将上清液装在平衡好的层析柱上；层析柱平衡使用6倍体积(约60 ml)以上的含50 mMKCl的溶液C，再次平衡；样品用含200 mM KCl的溶液C洗脱，一般准备50ml洗脱液。
[0022]将收集的每个部分在SDS-PAGE上电泳，用市售的Taq DNA聚合酶做对照(详见图
1)，进行蛋白质大小和纯度检测；电泳较亮的泳道表示Taq DNA聚合酶高含量，将这些部分(3，4，5，6)收集在一起；放在透析袋中使用500 ml溶液D透析，4°C，20小时左右，期间换一次透析液；最后收集得到高纯度Taq DNA聚合酶，经检测所得高纯度Taq DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0023]实施例6:Taq DNA聚合酶功能的PCR验证及琼脂糖电泳检测 以质粒PBI121作为PCR反应的DNA模板，以Kana标签引物作为PCR引物。
[0024]PCR反应体系总体积为25W，其中:10XPCR缓冲液(100 mmol/L Tris-HCl,pH 9.0 ；500 mmol/L KCl ；20 mmol/L MgCl2,0.1% 明胶，1% Triton X-100) 2.5 Pl，dNTPMixture (各2.5 mM)4ul，引物1.0 uM, Taq DNA聚合酶包括实施例5制备的Taq DNA聚合酶和市售的Taq DNA聚合酶，(制备的Taq DNA聚合酶分别稀释40倍，30倍，20倍，10倍；市售的Taq DNA聚合酶分别稀释8倍，7倍，6倍，5倍);DNA模板I W (20 ng);加灭菌双蒸水至25 W。应用ABI 9700 PCR仪进行PCR反应，反应程序如下:首先94 V预变性5min，之后进行30个循环，每个循环包括94 V变性30s、退火温度(退火温度视引物而定)30s、72°C延伸 I min，最后 72°C延伸 IOmin0
[0025]PCR产物在1%琼脂糖凝胶，I X TAE缓冲液中进行电泳；DNA标记为DL2000。电压90 V，时间40 min;凝胶成像系统进行观察拍照，结果如图2所示。将获得的PCR成像结果使用SensiAnsysl.0.3分析软件进行PCR产物定量统计，获得的统计数据结果如表1所示。根据统计数据计算出自制的Taq DNA聚合酶液的酶活达到16.7U/ul。
[0026]表1本发明制备的Taq` DNA聚合酶进行PCR检测获得的PCR产物片段定量统计数据(样品1-8对应图2中1-8泳道产物)
【权利要求】
1.一种重组Taq DNA聚合酶，其特征在于，其蛋白氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
2.一种编码权利要求1所述的重组Taq DNA聚合酶的基因，其特征在于，其核苷酸序列如 SEQ ID NO:1 所示。
3.一种制备权利要求1所述的重组Taq DNA聚合酶的方法，其特征在于，具体步骤如下: (1)克隆SEQID NO:1所示的核苷酸序列； (2)将步骤(1)所得的核苷酸片段和质粒pET32a进行连接，构建重组质粒pET32a_Taq ；(3)将重组质粒pET32a_Taq转化入大肠杆菌感受态细胞疋coliBL21中，获得表达菌株; (4)表达菌株利用LB培养液进行悬浮培养，37°C培养4.5小时后，加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导16-20小时后；解离菌体，过滤；获得所述重组Taq DNA聚合酶。
4.根据权利要求3所述的制备重组TaqDNA聚合酶的方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述解离菌体为采用溶菌酶解离菌体。
5.根据权利要求3所述的制备重组TaqDNA聚合酶的方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述过滤为以层析柱和透析袋连续过滤。
6.根据权利要求4所述`的制备重组TaqDNA聚合酶的方法，其特征在于，所述溶菌酶的浓度为4mg/ml。
7.根据权利要求5所述的制备重组TaqDNA聚合酶的方法，其特征在于，所述层析柱为Bio-Rex 70的离子交换柱树脂。
【文档编号】C12R1/01GK103602643SQ201310576003
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月18日 优先权日:2013年11月18日
【发明者】刘涛, 马秀芬 申请人:青岛思能基因生物技术有限公司