一种甜瓜甜味酸味性状相关基因功能性分子标记及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种甜瓜甜味酸味性状相关基因功能性分子标记及应用。利用Super-BAS技术，提供一种甜瓜甜味酸味性状相关基因功能性分子标记，确定了风味甜瓜甜味、酸味性状相关基因序列，并在此基础上成功开发了出一个甜味性状相关基因功能性分子标记SLAF18745-S01和三个个酸味性状相关基因功能性分子标记SLAF36334-S02、SLAF50072-S03和SLAF31212-S04，并通过甜味酸味标记辅助选择将传统的表型选择转变为直接选择基因型的应用对于甜瓜甜味、酸味性状的改良和改善具有重要的应用价值和意义。
【专利说明】一种甜瓜甜味酸味性状相关基因功能性分子标记及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及农业生物【技术领域】。具体的说，本发明涉及一种与甜瓜果实甜味、酸味性状相关基因功能性分子标记及其应用的【技术领域】。
【背景技术】 [0002]甜瓜Wucumis melo L.)属葫芦科甜瓜属，是一种重要的园艺作物，我国甜瓜的种植面积和产量均居世界第一。甜瓜是一种高多态性物种，含有各种不同果实风味的基因型。成熟甜瓜果实糖、酸组分及其含量对果实内在品质有着重要的影响，是决定果实风味的重要指标。甜、酸等风味的变化是一个复杂的过程，受一系列相关基因的影响和调控。定位甜瓜甜味、酸味性状相关基因并开发功能性标记，为提高甜瓜果实品质性状选育效率及甜瓜分子育种提供思路。
[0003]在现有甜瓜育种实践中，对甜味、酸味等风味性状大多是通过表现型间接对基因型进行选择，致使育种周期长，效率低，制约着甜瓜品种改良的进程。标记辅助选择，尤其是对与目标性状关联的功能性分子标记的选择可极大提高选择的效率，加速遗传改良。
[0004]现有技术中，功能性分子标记作为与表型相关的功能基因基序中功能性单核苷酸多态性(SNP)位点开发而成的分子标记。功能标记的开发必须具备以下两个条件:(I)有确定功能的候选基因并已知等位基因的序列彳目息；(2)在多个材料中对目标性状进行调查， 对目标基因进行序列分析，结合性状和基因序列信息进行基于连锁不平衡(LD)的关联分析。功能基因定位是功能性分子标记发掘的基础，目前功能基因定位常用的方法有基于传统遗传图谱定位与集群分离分析法(BSA)。Javier #等(2009)基于传统遗传图谱对甜瓜糖、酸性状进行了 QTL定位，但该方法的周期长、密度低、成本高；而基于传统集群分离分析法(BSA)可快速、有效寻找与目标基因紧密连锁的分子标记，但混池个数有限，一般不超过 10个，关联分析假阳性几率大，标记密度低。近年来发展的选择性基因型鉴定和集群分离分 |lf (.Super BSA), SLAFseq {Specific Location Amplified Fragments seg,特定位置扩增片段测序)，选择均匀分布在整个基因组、且避开重复序列区域的特异片段进行高深度测序，通过比较SNP标记的不同基因型在两个混池中出现频率的差异，确定与性状紧密相关的分子标记。Super BSA分子标记密度高，30-200个体的混池，保证了基因定位的功效和准确性。同时，由于SLAF标签中的多态性位点已经定位在基因组上，可以根据基因组的位置使用引物设计软件进行引物设计，开发功能标记。这些近几年发展起来的分子标记技术，通过分子标记辅助选择可以将传统的表型选择转变为直接选择基因型都具有重要的意义，但是至今未见开展甜瓜甜味酸味性状相关基因功能性分子标记方面的研究和报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的旨在针对现有技术的不足，利用Super-VAS技术，提供一种甜瓜甜味酸味性状相关基因功能性分子标记，确定了风味甜瓜甜味、酸味性状相关基因序列，并在此基础上成功开发了出一个甜味性状相关基因功能性分子标记SLAF18745-S01和三个个酸味性状相关基因功能性分子标记SLAF36334-S02、SLAF50072-S03和SLAF31212-S04，并通过甜味酸味标记辅助选择将传统的表型选择转变为直接选择基因型的应用对于甜瓜甜味、酸味性状的改良和改善具有重要的应用价值和意义。
[0006]本发明通过以下技术方案实现的:通过对甜味、酸味性状极端群体进行基于简化基因组测序(5ZA^-Seq)的选择性基因型鉴定和集群分离分析(5i//7ar-BAS)，结合生物信息学方法定位与甜味、酸味性状关联紧密的候选区域，获得性状相关候选基因，针对该候选基因开发出甜瓜甜味、酸味性状基因的功能性分子标记，达到选育甜酸味品系、缩短育种周期、提高选择准确率良好的技术效果。
[0007]本发明具体提供了一种甜瓜甜味酸味性状相关基因功能性分子标记，包括以下步
骤获得。[0008]( I)鉴定“风味四号”甜瓜的父本、母本、F1及F2群体单株果实风味。
[0009](2)对“风味四号”甜瓜父本、母本、F2群体中只甜不酸、只酸不甜、既不酸又不甜单株DNA分别等量混池建库，进行简化基因组测序，获得SLAF标签，并对SLAF标签进行单核苷酸(SNP)多态性分析。
[0010](3)根据多态性标记与甜味、酸味性状的关联性定位甜味、酸味性状侯选区域，并对候选区域基因进行功能注释。
[0011](4)根据定位的功能基因的SLAF标签序列，设计引物，开发甜味、酸味性状功能性标记。
[0012]进一步，本发明详细提供了一种甜瓜甜味酸味性状相关基因功能性分子标记，包括以下步骤获得。
[0013](I)对“风味四号”甜瓜的父本、母本、F1及F2代每个单株果实的甜酸味通过仪器测量结合品尝鉴定，获得只酸不甜、只甜不酸、既酸又甜、既不酸又不甜4种风味。
[0014](2)通过CTAB法提取父本、母本A1及F2代每个单株基因组DNA，分别等量混合父本、母本、只酸不甜、只甜不酸、既不酸又不甜每个单株基因组DNA，形成5个混池，分别对5 个混池基因组进行酶切，每个混池各单株同一位点处的DNA片段序列，经过PCR扩增、测序， Blat比对软件进聚类、Cap snp软件检测单核苷酸多态性，获得多态性的SLAF标签。
[0015](3)根据多态性标记与甜味、酸味性状的关联性使用比值关联法进行定位。分别计算群体既不酸又不甜的ac与甜不酸的ab之间和既不酸又不甜的ac与酸不甜的aa之间来源于不同基因型的差异比值，得到差异标记。将与甜味、酸味性状关联的差异标记通过blat 软件比对，在双亲基因组上定位，根据标记物理位置提取出标记所在的基因，与Swissprot 及Kegg数据库比对，得到与甜味性状、酸味性状相关的基因功能注释，挑选出处于功能基因外显子的SLAF标签。
[0016](4)根据定位的并处于外显子的一个甜味性状相关功能基因MEL03C011944T1 所在的标签SLAF18745的多态性序列、3个酸味性状相关功能基因MEL03C020002T1、 MEL03C025794T1、MEL03C026251T1 所在标签 SLAF36334、SLAF50072、SLAF51212 的多态性序列，利用Primer Primer5.0软件设计引物，以父本、母本、F1^ F2只甜不酸、只酸不甜、 既不酸又不甜材料为材料，进行PCR扩增，发展出一个甜味性状相关基因功能性分子标记 SLAF18745-S01和三个酸味性状相关基因功能性分子标记SLAF36334-S02、SLAF50072-S03 和 SLAF31212-S04。
【权利要求】
1.一种甜瓜甜味酸味性状相关基因功能性分子标记的获得方法，其特征在于，所述的获得方法包括以下步骤:(1)将高糖甜瓜自交系“寿星”为母本与自交系“酸甜瓜”为父本进行杂交，得到杂种F1 即“风味4号”;由杂种F1自花授粉获得F2代群体，对每个F2代单株果实的甜酸味通过仪器测量结合品尝进行鉴定，获得只酸不甜、只甜不酸、既酸又甜、既不酸又不甜4种风味；(2)通过CTAB法提取父本、母本、F1及F2代每个单株基因组DNA，分别等量混合父本、 母本、只酸不甜、只甜不酸、既不酸又不甜每个单株基因组DNA，形成5个混池，分别对5个混池基因组进行酶切，每个混池各单株同一位点处的DNA片段序列，经过PCR扩增、测序，Blat 比对软件进行聚类、Cap snp软件检测单核苷酸多态性，获得多态性的SLAF标签；(3)根据多态性标记与甜味、酸味性状的关联性使用比值关联法进行定位:分别计算群体既不酸又不甜的ac与甜不酸的ab之间和既不酸又不甜的ac与酸不甜的aa之间来源于不同基因型的差异比值，得到差异标记；将与甜味、酸味性状关联的差异标记通过blat软件比对，在双亲基因组上定位，根据标记物理位置提取出标记所在的基因，与Swissprot及 Kegg数据库比对，得到与甜味性状、酸味性状相关的基因功能注释，挑选出处于功能基因外显子的SLAF标签；(4 )根据定位的并处于外显子的一个甜味性状相关功能基因MEL03C011944TI所在的标签SLAF18745的多态性序列、3个酸味性状相关功能基因MEL03C020002T1、 MEL03C025794T1、MEL03C026251T1 的所在标签 SLAF36334、SLAF50072、SLAF51212 的多态性序列，利用Primer Primer5.0软件设计引物，以父本、母本、只甜不酸、只酸不甜、既不酸又不甜材料为材料，进行PCR扩增，发展出一个甜味性状相关基因功能性分子标记 SLAF18745-S01和三个酸味性状相关基因功能性分子标记SLAF36334-S02、SLAF50072-S03 和 SLAF31212-S04。
2.如权利要求1所述甜瓜甜味酸味性状相关基因功能性分子标记的获得方法，其特征在于，所述的一个甜味、三个酸味性状相关基因的功能性分子标记相应的DNA序列分别为:
3.一种甜味性状相关基因功能性分子标记SLAF18745-S01，其特征在于，甜味性状相关基因功能性分子标记SLAF18745-S01特异引物名称为SLAF_N0.1，序列为:
4.一种酸味性状相关基因功能性分子标记SLAF36334-S02、SLAF50072-S03和 SLAF31212-S04,其特征在于，酸味性状相关基因功能性分子标记SLAF36334-S02、 SLAF50072-S03 和 SLAF31212-S04 特异引物名称分别为 SLAF_N0.2、SLAF_N0.3、SLAF_N0.4， 其引物序列分别为:
5.一种如权利要求3所述的甜瓜甜味性状相关基因功能性分子标记的应用，其特征在于，将甜瓜甜味性状相关基因功能性分子标记SLAF18745-S01用于甜瓜品种或品系的甜味基因型检测中的应用，具体包括以下步骤:(1)以甜瓜自交系“寿星”与其他甜瓜杂交并繁衍至F2代以上；(2)对通过步骤(1)获得的甜瓜单个植株，提取基因组DNA，检测提取基因组的DNA 中是否存在与甜味性状相关功能基因MEL03C011944T1相连锁的分子标记；如有甜味性状功能性分子标记SLAF36334-S01出现，预测甜瓜植株是否具有甜味。
6.一种如权利要求4所述的甜瓜酸味性状相关基因功能性分子标记的应用，其特征在于，酸味性状相关基因功能性分子标记SLAF36334-S02、SLAF50072-S03和SLAF31212-S04 用于甜瓜品种或品系的酸味基因型检测中的应用，具体包括以下步骤:(1)以甜瓜自交系“酸甜瓜”与其他甜瓜杂交并繁衍至F2代以上；(2)对通过步骤(1)获得的甜瓜单个植株，提取基因组DNA，检测提取基因组的DNA 中是否存在与酸味性状相关功能基因MEL03C020002T1、MEL03C025794T1、MEL03C026251T1 相连锁的分子标记；如有酸味性状功能性分子标记SLAF36334-S02、SLAF50072-S03和 SLAF31212-S04出现，预测甜瓜植株是否具有酸味。
【文档编号】C12N15/10GK103555717SQ201310575600
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月18日 优先权日:2013年11月18日
【发明者】张红, 吴明珠, 张永兵, 张学军, 吴海波, 伊鸿平 申请人:新疆农业科学院哈密瓜研究中心