一种与香猪产仔数相关的snp分子标记及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种与香猪产仔数相关的SNP分子标记，其特征在于：SNP标记为位于香猪NCBI猪参考基因组Sscrofa 10.2的chr17:17089983，该SNP位点的两种等位基因为T或C，三种基因型分别命名为CC、TT和CT型，分别对应于chr17:17089983的碱基是纯合的CC、TT，或杂合的CT类型，TT和CT基因型对应于1胎2胎和3胎的产仔数较高。
【专利说明】
一种与香猪产仔数相关的SNP分子标记及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及家畜分子生物学检测领域，具体来说，涉及一种与香猪产仔数相关的 SNP标记及其应用技术。
【背景技术】
[0002] 产仔数是养猪业重要的经济性状(曹清果，2004)，是猪遗传育种研究的热点和重 点。香猪是我国珍贵的小型地方猪种，具基因纯合度高、肌纤维细、脂肪颗粒小、肉质香糯、 早熟易繁等特点，适于制作高质量肉品。我们在贵州从江县发现香猪群体中产仔数存在较 大的差别，是猪繁殖调控研究和品种选育的良好遗传材料。
[0003] 猪的产仔数性状是数量性状，调控基因中有几个主效基，更多的是微效基因。基于 芯片的全基因组关联分析(Genome-wide association study，GWAS)技术已用于数量性状 的基因座(quantitative trait locus，QTL)的筛选研究。全基因组关联分析是指在猪全基 因组范围内筛选出SNP位点，经过分群和SNP位点分型，利用统计学的方法，从中筛选出与某 些性状相关联的SNP，进而得到控制或者影响猪繁殖性状的QTL。我们的前期研究中应用 Illumina Porcine SNP60K基因芯片，对香猪进行了全基因组关联分析，筛选出某些SNP位 点具有多态性，与香猪的产仔数显著相关。这些候选位点在较大的香猪群体中是否真实存 在、如何影响香猪的产仔数，需要建立一种技术和方法，便于进行群体基因分型研究和应 用。本发明描述一个SNP位点基因型的AS-PCR检测方法，目的在于适用于改善香猪产仔数的 分子辅助选择技术。
[0004] SNP是一种在动物基因组中存在的数目多、分布广泛且相对稳定的遗传标记，主要 指基因组核苷酸水平上的变异引起的序列多态性，包括单碱基的转换、颠换，以及单碱基的 插入、缺失等(杨昭庆等，2000)。作为第三代分子标记，已广泛应用于生物、农学、医学、生物 进化等领域，在分子遗传学、药物遗传学、法医学以及疾病的诊断和治疗等方面发挥着重要 作用（唐立群等，2012)。目前SNP检测常用方法有：单链构象多态性（single-strand conformation polymorphism, SSCP)、等位基因特异性 PCR(allele_spec ific PCR，AS-PCR)、直接测序、DNA芯片等(许家磊等，2015)，其中AS-PCR方法适于群体检测。
[0005] AS-PCR方法的原理是，由于Taq DNA聚合酶对位于引物3'末端的单个碱基的错配 无法修复，当引物3'末端的碱基与SNP位点的等位基因互补配对时，才能发生扩增反应；当 引物3'末端的碱基与SNP位点的等位基因不匹时，则扩增反应不能发生（Suzuki et al.， 1991)。每个SNP位点的检测需要设计三条不同的引物，其中一条是通用的引物，另两条是分 别对应SNP位点的两个等位基因的特异性引物。以每个个体的基因组DNA为模板进行PCR扩 增，PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测，依据电泳条带的有和无确定SNP的基因型。理论上，引物 3'末端的碱基与DNA模板发生完全互补配对时，Taq DNA聚合酶才能使扩增反应有效地进 行。然而多项研究表明，在某些情况下即使引物3'末端的碱基与DNA模板不是完全的互补配 对，延伸反应仍然可以发生(Ugozzoli et al.，1991)。为了解决这一问题，人为地在3'末端 倒数第二或第三位引入错配的碱基，能够显著提高引物的特异性，降低假阳性率(Hayashi et al·，2004)〇
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是:提供一种与香猪产仔数相关的SNP标记及其应用。
[0007] 本发明的技术方案是:一种与香猪产仔数相关的SNP标记，位于香猪NCBI猪参考基 因组Sscrofa 10.2的(：1^17:17089983(^:339042644)，该5陬位点的两种等位基因为1'或(：， 三种基因型分别命名为CC、TT和CT型，分别对应于chrl7:17089983的碱基是纯合的CC、TT， 或杂合的CT类型。
[0008] 本发明还提供用于检测香猪产仔数性状的SNP标记的一组引物，所述的引物分别 为:末位锚定引物U1 (上游引物）：5 ' -TGGATGTGTGGTAAGGGAGAGAT-3 '，末位锚定引物U2 (上游 引物）：5'-TGGATGTGTGGTAAGGGAGAGAC-3' 和下游引物D3:5'_ AAAGACTGGTAGGTCAAAGAGTATGC-3'，目的序列分别为SEQ ID No.l和SEQ ID Νο·2。
[0009] 本发明还提供所述SNP标记在不同产仔数香猪群中的检测方法。
[0010]该方法包括以下步骤：
[0011] (1)提取待测香猪的基因组DNA;
[0012] (2)以待测香猪的基因组DNA为模板，分另_用引物U1、U2和D3，进行AS-PCR检测， 确定香猪SNP位点chrl7:17089983的基因型；
[0013] (3)1.5%琼脂糖凝胶电泳检测AS-PCR产物，凝胶成像系统记录条带并判断基因 型。如待测个体该位点基因型为CT型或TT型，可将待测个体视为有较高产仔数优势的香猪 个体，可选择留作种公猪或种母猪，以提高后代的产仔数;如基因型为CC型，可将待测个体 视为产仔数较低的个体，不用于提高后代的产仔数的亲本。
[0014] 步骤(2)中进行AS-PCR所使用的扩增体系为20yL，计为：2XTaq PCR Master Mix 1 OyL，1 Ομπιο 1 /L 引物U1 /U20 · 2yL，1 Ομπιο 1 /L 引物D30 · 2yL，ddH20 8 · 6yL，1 Ong/yL基因组DNA lyL。进行AS-PCR采用的反应条件：1)预变性:94.0°C5min;2)扩增反应:变性:94.0°C30sec， 退火：60.0。(：-66.0 1€3086(3，延伸：72.01€4586(3,30个循环；72.0。(：1011^11 〇
[0015] 本发明进一步提供所述SNP标记在鉴定产仔数及与香猪产仔数性状相关的分子标 记辅助育种中的应用。
[0016] 前述的应用包括以下步骤：
[0017] (1)采用AS-PCR技术检测SNP位点chrl7:17089983在群体中的基因型分布情况，筛 选出与香猪产仔数性状相关的SNP标记；
[0018] (2)应用SPSS V22.0中的Spearman相关系数进行双侧检验，分析该SNP位点的基因 型与母猪每胎产仔数的相关性。
[0019] (3)根据SNP位点chrl7:17089983基因型进行高产仔数优势香猪的选育。
[0020] 本发明对香猪SNP位点chrl7:17089983进行基因型检测，并对该位点的基因型与 香猪的产仔数性状进行相关性分析。应用经SPSS V22.0软件的X2检验分析，得出香猪高产 群和低产群该SNP位点基因型的分布频率差异极显著（？〈0.001)。将3~?位点(：1^17 : 17089983的基因型与各胎次的产仔数进行相关性分析，应用SPSS v22.0中的Spearman相关 系数进行双侧检验，得出SNP位点chrl7:17089983的基因型与第1胎、第2胎产仔数呈弱相关 关系(〇.2〈0〈〇.4，？〈〇.〇〇1) ;与第3胎产仔数呈极弱相关(〇.〇〈0〈〇.2,〇.〇1〈?〈〇.〇5)。说明不 同基因型对香猪各胎次的产仔数存在影响。香猪第1-3胎平均产仔数规律是，TT型香猪的产 仔数最高，CC型最低，CT型居中；ΤΤ型香猪的第1胎产仔数平均比CC型多1.33头仔数，ΤΤ型香 猪的第2胎产仔数平均比CC型多1.81头仔数，ΤΤ型香猪的第3胎产仔数平均比CC型多2.88头 仔数。说明ΤΤ基因型的香猪的产仔数高于CC基因型。因此SNP位点chrl7:17089983,可作为 与产仔数相关的分子标记，为香猪的产仔数性状标记辅助选择提供了科学依据。
[0021]本发明的有益效果：（1)本发明提供的分子标记可不受香猪年龄、性别等因素的限 制，可用于高产仔数香猪的早期选择，降低香猪的选育成本。
[0022] (2)本发明建立的检测香猪SNP位点chrl7:17089983基因型的方法准确可靠，操作 简便。
[0023] (3)香猪SNP位点chrl7:17089983基因型的检测，为香猪产仔数的分子标记辅助选 择技术奠定理论基础。
【附图说明】
[0024] 图1为本发明实施例1中SNP位点chrl7:17089983基因型分型结果；
[0025]图2为本发明实施例2中SNP位点chrl7:17089983在香猪高低产群体间的基因型频 率分布。
【具体实施方式】
[0026] 以下实例对本发明做进一步的解释，但不限定本发明的范围，若无特别指明，实施 例中所用的技术方法和条件均为本领域技术人员所熟知的技术方法和常规实验条件，或按 照相关试剂厂商说明书建议的方法和条件。
[0027] 实施例1香猪产仔数相关的SNP标记的检测技术，步骤如下：
[0028] 1、基因组DNA提取
[0029] 本试验采用购自天根生化科技(北京)有限公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取 试剂盒，用于从血液或组织中提取基因组DNA，具体方法如下：
[0030] 1)处理材料
[0031] 提取材料为血液时，可直接使用200yL新鲜、冷冻或加入各种抗凝剂的血液，不足 200yL可加缓冲液GA补足。
[0032] 提取材料为组织时，可取50mg组织(脾组织用量应少于10mg)打碎处理为细胞悬浮 液，然后l〇,〇〇〇rpm(ll，200Xg)离心lmin，倒尽上清，加200yL缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。 [0033] 2)加入20yL蛋白酶K，漩涡混匀，提取血液基因组时，即可继续进行下一步;提取组 织基因组时，56.0°C消化2-4h(每隔0.5h混匀一次)至组织块消化完全；
[0034] 3)加入200yL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70 · 0 °C消化lOmin;
[0035] 4)加入200yL无水乙醇，漩涡混匀；
[0036] 5)将消化液倒入吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm离心30sec，弃废 液，将吸附柱CB3放回收集管中；
[0037] 6)向吸附柱CB3中加入500yL缓冲液⑶，12000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱CB3 放回收集管中；
[0038] 7)向吸附柱CB3中加入600yL漂洗液PW，12000rpm离心30sec，弃废液，将吸附柱CB3 放回收集管中；
[0039] 8)重复操作步骤7) -次；
[0040] 9)将吸附柱CB3放回收集管中12000rpm空离心2min，弃废液，将吸附柱CB3置于室 温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液成份；
[0041 ] 10)将吸附柱转移到干净的2mL离心管中，向吸附柱中部悬空加入50-200yL洗脱液 TE，室温放置2-5min，12000rpm离心2min;基因组DNA存在于离心管中TE溶液中，4.0°C备用 或-20.0 °C保存。
[0042] 11)为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的TE溶液再重复加入吸附柱CB3中，放 置 2min，12000rpm 离心 2min;
[0043] 2、目标序列的扩增
[0044] 本发明中SNP位点位于chrl7 :17089983(T/C)，参考NCBI Genbank收录的相应序 列，使用Primer Premier 5.0软件设计三条特异性引物，其中U1与U2为末位锚定引物U1: 5 ' -TGGATGTGTGGTAAGGGAGAGAT-3 '，U2:5 ' -TGGATGTGTGGTAAGGGAGAGAC-3 ' ；反向引物D3:5 ' -AAAGACTGGTAGGTCAAAGAGTATGC-3 '。03分别与U1、U2组合进行AS-PCR检测，每个样本分别进 行三次重复检测，目的片段均为361bp，测序后得出目标序列分别为SEQ ID No.l和SEQ ID No. 2〇
[0045] AS-PCR所使用的扩增体系为20yL，计为：2XTaq PCR Master Mix 10yL，10ymol/L 引物U1 或 U2 取0.2yL，1 Ομπιο 1/L 引物D3 取0.2yL，ddH20取 8.6yL，lOng/yL 基因组DNA 取 lyL。
[0046] 进行AS-PCR采用的反应条件：1)预变性:94.0 °C 5min; 2)扩增反应:变性:94.0 °C 308〇(：，退火：60.0。(：-66.01€3086(3，延伸：72.0 1€4586(3,30个循环；72.0。(：1011^11〇
[0047] 3、AS-PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测及基因型判断
[0048] AS-PCR结束后，取5yLPCR产物经1.5%的琼脂糖电泳检测，0.5yg/mL溴乙锭染色， 凝胶成像系统记录条带。
[0049]每个样品，以引物D3分别与U1、U2组合进行两个AS-PCR检测。若引物U1/D3,引物 U2/D3均扩增出条带，将基因型定义为CT;若引物U1/D3扩增出36 lbp的条带，引物U2/D3没有 条带出现，将基因型定义为CC型；若引物U1/D3检测没有得到条带，引物U2/D3出现一条 361bp的条带，将基因型定义为TT型（图1)。
[0050] 实施例2SNP位点chrl7:17089983基因型与产仔数的相关性与检测应用 [00511按照实施例1的方法，以采自贵州从江县香猪高低产群共654头（高产129头，低产 525头)为试验材料，以chrl7:17089983为候选SNP位点，利用AS-PCR技术检测该SNP位点的 基因型在两个群体中的分布情况，应用SPSS v22.0软件中的双侧检验分析该SNP位点的基 因型与每胎产仔数的相关性。结果显示，该SNP位点在香猪高产群和低产群中，基因型的分 布频率差异极显著(P〈0.001)，如表1和图2所示。
[0052] 表1SNP位点chrl7:17089983的基因型及基因频率
[0054] 备注:香猪高产群的T等位基因频率与香猪低产群的T等位基因频率相比，P〈0.01 表示差异极显著。
[0055] 应用SPSS ν22·0中的Spearman相关分析，将SNP位点chrl7:17089983的基因型与 个体的繁殖性状即各胎次产仔数和乳头数进行相关性分析(表2)。结果显示:该SNP位点的 基因型与香猪第1胎、第2胎产仔数呈弱相关关系(0.20〈0.4，？〈0.01);与第3胎产仔数呈极 弱相关(〇.〇〇〈〇.2,0.01〈?〈0.05)。说明不同基因型对香猪各胎次的产仔数存在影响 [0056] 表2SNP位点chrl7:17089983的基因型与产仔数的相关性分析
[0058]使用SPSS软件统计出每种基因型对应的各胎次的平均产仔数(表3)，表明，第1-3 胎平均产仔数规律是，TT型香猪的产仔数最高，CC型最低，CT型居中；TT型香猪的第1胎产仔 数平均比CC型多1.33头仔数，TT型香猪的第2胎产仔数平均比CC型多1.81头仔数，TT型香猪 的第3胎产仔数平均比CC型多2.88头仔数。说明TT基因型的香猪的产仔数高于CC基因型。
[0059]表3不同基因型各胎次平均产仔数
【主权项】
1. 一种与香猪产仔数相关的SNP分子标记，其特征在于：SNP标记为位于香猪NCBI猪参 考基因组Sscrofa 10.2的chrl7:17089983,该SNP位点的两种等位基因为T或C，三种基因型 分别命名为CC、TT和CT型，分别对应于chrl7:17089983的碱基是纯合的CC、TT，或杂合的CT 类型。2. 根据权利要求1所述的一种与香猪产仔数相关的SNP分子标记，其特征在于：SNP标记 的一组引物，所述的引物分别为:末位锚定引物U1:5 ' -TGGATGTGTGGTAAGGGAGAGAT-3 '，末位 锚定引 物 U2:5'-TGGATGTGTGGTAAGGGAGAGAC-3' 和下游弓| 物 D3:5'_ AAAGACTGGTAGGTCAAAGAGTATGC-3'，目的序列分别为SEQ ID No.l和SEQ ID Νο·2。3. 如权利要求1-2之一所述的一种与香猪产仔数相关的SNP分子标记的检测方法，其特 征在于：包括以下步骤：（1)提取待测香猪的基因组DNA; (2)以待测香猪的基因组DNA为模 板，分别利用引物U1、U2和D3,进行AS-PCR检测，确定香猪SNP位点chrl7:17089983的基因 型；（3)1.5%琼脂糖凝胶电泳检测AS-PCR产物，凝胶成像系统记录条带并判断基因型。4. 根据权利要求3所述的一种与香猪产仔数相关的SNP分子标记的检测方法，其特征在 于:步骤(2)中进行AS-PCR所使用的扩增体系为20yL，计为:2XTaq PCR Master Mix 10yL， lOymol/L引物U1/U2 0.2yL，10ymol/L引物D3 0.2yL，ddH20 8.6yL，10ng/yL基因组DNA 1μ L;进行AS-PCR采用的反应条件：1)预变性:94.0 °C 5min; 2)扩增反应:变性:94.0 °C 30sec，退 火：60.0。〇66.01€3086。，延伸：72.01€4586。，30个循环 ；72.0。(：1011^11。5. 如权利要求1或2所述的一种与香猪产仔数相关的SNP分子标记在鉴定产仔数及与香 猪产仔数性状相关的分子标记辅助育种中的使用方法，其特征在于:包括以下步骤：（1)采 用AS-PCR技术检测SNP位点chrl7:17089983在群体中的基因型分布情况，筛选出与香猪产 仔数性状相关的SNP标记；（2)应用SPSS v22.0中的Spearman相关系数进行双侧检验，分析 该SNP位点的基因型与母猪每胎产仔数的相关性；（3)根据SNP位点chrl7:17089983基因型 进行高产仔数优势香猪的选育。
【文档编号】C12Q1/68GK105969890SQ201610531708
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年7月7日
【发明人】王嘉福, 冉雪琴, 牛熙, 王洋
【申请人】贵州大学