大白菜抗根肿病CRb基因的共分离分子标记TCR541、引物及应用
【专利摘要】本发明公开了一种大白菜抗根肿病CRb基因的共分离分子标记TCR541，该分子标记TCR541与CRb基因共分离，可用于芸薹种包括结球白菜和青梗菜抗根肿病基因的分子标记辅助选择。在辅助选择过程中同时使用这些标记，选择理论准确度可达到100％，并且该标记重复性好，可靠性高，检测成本低，省时省力。
【专利说明】
大白菜抗根肿病CRb基因的共分离分子标记TCR541、引物及 应用
技术领域
[0001 ]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种大白菜抗根肿病CRb基因的共分离分子 标记TCR541、引物及应用。
【背景技术】
[0002] 2002年，本课题组获得了 1份抗芸薹根肿病的大白菜双单倍体系'CR Shinki DH' 系，研究表明该抗病材料抗芸薹根肿菌生理小种2、4和8(Piao等，Conversion of AFLP marker linked to clubroot resistance gene into SCAR marker·2002，J Kor Soc Hort Sci 43:653-665)。进一步研究证明抗根肿病基因为显性单基因，并命名为CRb(Piao 等，SCAR and CAPS mapping ofCRb,a gene conferring resistance to Plasmodiophora brassicae in Chinese cabbage(Brassica rapa ssp.pekinensis)，TheorAppl Genet， 2004，108:1458-1465)。
[0003] 在芸薹种抗根肿病品种转育过程中，每代都需要采用田间接种根肿病菌的方法鉴 定中间材料的基因型，而且环境条件会影响到正确中间材料的选择，这样势必影响转育进 程，因此抗病品种转育难的问题还没有彻底解决。分子标记辅助选择技术(MAS)可能是最终 解决这一问题的有效途径。
[0004] 目前，国内沈阳农业大学朴钟云课题组获得了与芸薹种抗根肿病基因 CRb连锁的 标记（2004,2014)，包括TCR01，TCR05和TCR09,见（Piao等，SCAR and CAPS mapping of CRb,a gene conferring resistance to Plasmodiophora brassicae in Chinese cabbage(Brassica rapa ssp.pekinensis)，以及TCR108、TCR30、TCR74、TCR79，M(Zhang 等，Fine genetic and physical mapping ofthe CRb gene conferring resistance to clubroot disease in Brassica rapa.，Mol Breeding，34:1173-1183)。但这些标记并不 是与CRb共分离的标记，利用这些标记进行分子标记辅助选育时容易造成连锁累赘。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种大白菜抗根肿病CRb基因的共分离分子标记TCR541、弓丨 物及应用，利用该分子标记可对待测植株进行苗期鉴定，从而减少连锁累赘，简化大白菜抗 根肿病品种的转育程序。
[0006] 本发明提供了一种大白菜抗根肿病CRb基因的共分离分子标记TCR541，所述大白 菜抗根肿病CRb基因的共分离分子标记TCR541的核苷酸序列为：
[0008]本发明还提供了一种上述大白菜抗根肿病CRb基因的共分离分子标记TCR541的 PCR特异性扩增引物，包括：
[0009] F TCR541:5-TGCTTGAGCAGAAACAATATCAA-3 '
[0010] R TCR541:5 '-TTGCGCATCTCTGTTTAGCTT-3 '。
[0011 ]本发明还提供了 一种大白菜抗根肿病CRb基因的共分离分子标记TCR541，在分子 标记辅助选择中的应用。
[0012]本发明还提供了 一种大白菜抗根肿病CRb基因的共分离分子标记TCR541，在大白 菜抗根肿病分子标记辅助选择中的应用。
[0013] 本发明还提供了一种上述大白菜抗根肿病CRb基因的共分离分子标记TCR541的应 用方法，具体包括：
[0014] (1)用CTAB方法提取待测材料的基因组DNA
[0015] ⑵PCR扩增
[0016] a.反应体系：10yL体系，各组分物质的含量分别为15ng模板DNA;5pmol · I/1引物； l.Ommol.L-MNTPd.OuL 10XPCR Buffer;0.5U Taq DNA聚合酶；ddH20补齐 10yL，混匀，离 心，
[0017] 其中引物的序列为F TCR541:5'-TGCTTGAGCAGAAACAATATCAA-3'，
[0018] R TCR541:5 '-TTGCGCATCTCTGTTTAGCTT-3 '；
[0019]匕扩增程序：94°(：预变性51^11;94°(：变性3〇8;60°(：退火458 ;72°(：延伸3〇8;35个循 环后;72°C延伸lOmin;最后4°C保存；
[0020] C.电泳:将扩增产物与等体积的上样缓冲液混合，94°C变性6min，之后在DNA测序 电泳仪上进行6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，70W条件下电泳2小时，电泳结束后，进行银染， 并观察扩增结果；
[0021] d.判断:扩增结果中如果能够检测到252bp和大于252bp两条带，则待测材料中含 有大白菜抗根肿病基因 CRb的概率为100%。
[0022]本发明提供的一种大白菜抗根肿病CRb基因的共分离分子标记TCR541，与芸薹种 抗根肿病基因 CRb共分离，可广泛应用于芸薹种抗根肿病基因 CRb的分子标记辅助选择育 种。本发明通过特异引物PCR扩增可对待测植株进行苗期鉴定，大大提高育种效率，缩短育 种进程。
【附图说明】
[0023] 图1为TCR540和TCR541在抗病材料'CRBJN3-2'、感病材料'BJN3-2'以及重组体中 的扩增结果；
[0024] 图2为大白菜抗根肿病CRb基因的遗传连锁图谱。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明进行详细说明，但应当理解本发明的保护 范围并不受【具体实施方式】的限制。
[0026] -、大白菜抗根肿病CRb基因的共分离分子标记TCR541和TCR540的获得
[0027] 1、分离群体的构建
[0028]以含抗根肿病基因 CRb的大白菜品系'CRBJN3-2'为父本，易感染根肿病的大白菜 品系' B JN3-2 '为母本杂交获得?:，所获FHf植株全部表现为抗病。以上两个亲本' CRBJN3-2 ' 和'BJN3-2'均保存于沈阳农业大学。选择单株Fi自交构建内代作图群体，群体数为4783个。 播种的全部4783个F 2群体，种植10天后接种根肿菌。40天后进行抗病性鉴定，4783个F2群体 中3641个抗病，1142个感病，经卡方检验符合3:1的分离比（X2 =3.16 =3.84)。
[0029] 2、CTAB 法提取 DNA
[0030] 1)、在1.5ml离心管中加入498uL 1 X CTAB提取液以及2uLf3-巯基乙醇，摇匀，其中1 X CTAB提取液包含2% 的CTAB，100mmol/L的Tris-HCl，20mmol/L的EDTA和 1 · 4mol/L的NaCl， 其中2%的CTAB指的质量浓度为2%(w/v);
[0031] 2)、取0.2g幼嫩叶片，在液氮条件下研磨至粉末，加入到含有CTAB提取液和β-巯基 乙醇的离心管中，摇匀；
[0032] 3)、随后将离心管放入65°C水浴中，每隔5分钟摇一次，水浴30min;
[0033] 4)、取出离心管，加入等体积的氯仿:异戊醇混合物(24:1，v/v)，摇晃lOmin后，常 温下 12000r/min 离心 lOmin;
[0034] 5)、将上清液转移到另一离心管中，加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1，v/v)，摇晃 lOmin后，常温下 12000r/min离心 lOmin;
[0035] 6)、将上清液移至另一离心管当中，加入2倍体积事先预冷的无水乙醇，混匀后，将 抱团的DNA挑入到装有400uL TE缓冲液的离心管中溶解；
[0036] 7)、加入 1.5uL RNaseA(10ug/uL)，混匀后37Γ保存30min;
[0037] 8)、重复步骤5);
[0038] 9)、将上清液转移到另一离心管中，向离心管中加入50uL 3mol/L NaAC溶液和预 冷的等体积的异丙醇，-20 °C沉淀20min;
[0039] 10)、4°C条件下12000r/m离心10min，弃掉上清液，加入75%的乙醇清洗2次；
[0040] 11)、在超净工作台上风干DNA，加入50yL TE (Tri s-EDTA)溶解DNA，-20 °C冰箱中保 存。
[0041 ]二、大白菜抗根肿病CRb基因的共分离分子标记TCR541和TCR540的获得和鉴定 [0042] 1、多态性引物的筛选
[0043] 根据朴钟云课题组2014年发表的抗根肿病CRb基因的2个侧翼标记TCR79和TCR108 序列（Zhang等，Fine genetic and physical mapping of the CRb gene conferring resistance to clubroot disease in Brassica rapa.，Mol Breeding,34:1173-1183), 将该基因锚定在大白菜A3连锁群83.5kb区间内。分析Brassica Database数据库(http:// brassicadb.org)序列信息，发现目标区域存在15个基因。根据这15个基因的基因功能，对 其中5个抗病相关基因在抗病材料' CRBJN3-2 '上进行测序。对测序结果进行比对，发现抗病 材料中有3个基因的序列与Brassica Database数据库(http://brassicadb.org)中参考基 因组序列存在差异。因此，根据抗病材料的测序结果，利用Primer5.0软件，共设计3对引物。 [0044]利用设计的3对引物扩增亲本' CRBJN3-2 '和' BJN3-2 '的DNA，其中有2对引物在亲 本间具有多态性，并分别命名为TCR540和TCR541，TCR540和TCR541对应的分子标记的序列 分别为：
[0045] (l)TCR540(148bp)的核苷酸序列如SEQ ID N0.1 所示，为：
[0047] (2)TCR541(252bp)的核苷酸序列如SEQIDN0.4所示，为：
[0049] 根据上述序列分别设计并合成了针对TCR540的一对引物F TCR540/R TCR540,以 及针对TCR541的一对引物F TCR541/R TCR541，具体序列如下：
[0050] (1)TCR540的引物：
[0053] (2)TCR541 的引物：
[0056] 2、分子标记的鉴定
[0057] 为了验证这些分子标记的可靠性，首先，利用CRb两翼连锁标记TCR79和TCR74见 (Zhang等，Fine genetic and physical mapping of the CRb gene conferring resistance to clubroot disease in Brassica rapa·，Mol Breeding，34:1173-1183)筛 选1142株F2代感病个体中的重组体；然后，利用TCR540的引物（F TCR540/R TCR540)和 TCR541的引物(F TCR541/R TCR541)分别对含抗根肿病基因 CRb的大白菜'CR BJN3-2'和易 感根肿病的大白菜自交系'BJN3-2 '及其44fF2代感病重组体进行了PCR扩增。扩增结果表 明如图1所示，图1A为TCR540在抗病材料' CRBJN3-2 '（R泳道）、感病材料' BJN3-2 '（S泳道）以 及重组体（1-44号泳道）中的扩增结果，使用TCR540的引物进行扩增，在抗病亲本'CRBJN3-2 '上能扩增出一条148bp的条带，在感病亲本' BJN3-2 '和44株?2代感病重组体上均能扩增 出一条大于148bp的条带；图1B为TCR541在抗病材料' CR BJN3-2 '（R泳道）、感病材料' BJN3-2'（S泳道）以及重组体(1-44号泳道)中的扩增结果，使用TCR541的引物进行扩增，在抗病亲 本' CRBJN3-2 '上能扩增出一条252bp的条带，在感病亲本' BJN3-2 '和44株?2代感病重组体 上均能扩增出一条大于252bp的条带。
[0058] 3、遗传图谱的构建
[0059] 根据F2群体的筛选鉴定结果，计算各标记与CRb基因间的重组率，Mapchart2.1绘 制CRb基因的遗传连锁图谱（图2)，图右侧标记之间的数字表示标记间的重组体数，图左侧 的数字表示两标记之间的遗传距离，由图可知!'0?79、1'0?108、1'0?30、1'0?37、1'0?74，分别定 位于距离CRb基因0.03cM、0.04cM、0.36cM、0.43cM、0.49cM处。而新开发的分子标记TCR540、 TCR541与CRb基因存在共分离关系。因此，确定这2个标记可以运用到今后大白菜抗根肿病 CRb基因的分子标记辅助选育过程当中，并且由于这2个分子标记为共分离标记，与之前的 连锁标记相比，在分子标记辅助育种的应用中能够消除连锁累赘现象，大大提高转育效率。
[0060] 三、大白菜抗根肿病CRb基因的共分离分子标记TCR541和TCR540在辅助选择大白 菜抗根肿病植株中的应用方法，具体包括：
[0061 ] 1、用CTAB方法提取待测材料的基因组DNA
[0062] 用CTAB方法提取待测大白菜材料的基因组DNA，具体步骤参照上文中"一、大白菜 抗根肿病CRb基因的共分离分子标记TCR541和TCR540的获得"中"2、CTAB法提取DNA"部分记 载的内容。
[0063] 2、PCR 扩增
[0064] a.反应体系：10yL体系，各组分物质的含量分别为15ng模板DNA;5pmol · L-1引物； l.Ommol.L-MNTPd.OuL 10XPCR Buffer;0.5U Taq DNA聚合酶；ddH20补齐 10yL，混匀，离 心，
[0065]其中，TCR540使用的引物的序列为：
[0066] F TCR540:5 '-TGACATTGTTGATGTGCTGA-3 '，
[0067] R TCR540:5 '-AAATATGCCTTCAATTGCTTC-3 '，
[0068] TCR541使用的引物的序列为：
[0069] F TCR541:5 '-TGCTTGAGCAGAAACAATATCAA-3 '，
[0070] R TCR541:5 '-TTGCGCATCTCTGTTTAGCTT-3 '；
[0071] 匕扩增程序：94°(：预变性51^11;94°(：变性3〇8;60°(：退火458 ;72°(：延伸3〇8;35个循 环后;72°C延伸lOmin;最后4°C保存。
[0072] 3、电泳：
[0073] TCR540:将扩增产物与等体积的上样缓冲液混合，94°C变性6min，之后在DNA测序 电泳仪上进行6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，70W条件下电泳1.5小时，电泳结束后，进行银 染；
[0074] TCR541:将扩增产物与等体积的上样缓冲液混合，94°C变性6min，之后在DNA测序 电泳仪上进行6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，70W条件下电泳2小时，电泳结束后，进行银染。
[0075] 需要说明的是，上样缓冲液采用聚丙烯酰胺凝胶电泳常用的缓冲液，其中包含 98%(w/v)的formamide，10mM的EDTA，0·001 %(w/v)的xylene cyanol和0·001 %(w/v)的 bromphenol blue。
[0076] 4、结果分析
[0077] ①在使用TCR540的引物的扩增结果中如果能够检测到148bp和大于148bp两条带， 则待测材料中含有大白菜抗根肿病基因 CRb的概率为100 %。
[0078]②在使用TCR541的引物的扩增结果中如果能够检测到252bp和大于252bp两条带， 则待测材料中含有大白菜抗根肿病基因 CRb的概率为100 %。
[0079] 如果①、②2项中的扩增结果均可获得，则待测材料具有大白菜抗根肿病基因 CRb 的概率为100 %。
[0080] 尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造 性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优 选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0081] 显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精 神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围 之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
【主权项】
1. 一种大白菜抗根肿病CRb基因的共分离分子标记TCR541，其特征在于，所述大白菜抗 根肿病CRb基因的共分离分子标记TCR541的核苷酸序列为： 5'-TGCTTGAGCAGAAACAATATCAAAAATCTACCTGGAAGCATCAAGAAACTTCATCATCTCAAATCTCTTT ACTTGCATTGTCAACAGCTCGTTTCTCTTCCACTGCTTCCATCAAATCTGCAGTATCTGGATGCTCATGGCTGTATC TCACTCGAAACAGTGGCTAAACCCATGACGCTTCTTGTGGTAGCTGAAAGGAACCAGTCTACTTTCGTCTTCACTGA TTGTTTCAAGCTAAACAGAGATGCGCAA-3'〇2. -种权利要求1所述的大白菜抗根肿病CRb基因的共分离分子标记TCR541的PCR特异 性扩增引物，包括： F TCR541:5 '-TGCTTGAGCAGAAACAATATCAA-3 ' R TCR541:5 '-TTGCGCATCTCTGTTTAGCTT-3 '。3. 根据权利要求1所述的大白菜抗根肿病CRb基因的共分离分子标记TCR541，在分子标 记辅助选择中的应用。4. 根据权利要求1所述的大白菜抗根肿病CRb基因的共分离分子标记TCR541，在大白菜 抗根肿病分子标记辅助选择中的应用。5. -种权利要求1所述的大白菜抗根肿病CRb基因的共分离分子标记TCR541的应用方 法，具体包括： (1) 用CTAB方法提取待测材料的基因组DNA (2) PCR扩增 a. 反应体系：10yL体系，各组分物质的含量分别为15ng模板DNA;5pmol · I/1引物； l.Ommol.L-MNTPd.OuL 10XPCR Buffer;0.5U Taq DNA聚合酶；ddH20补齐 10yL，混匀，离 心， 其中引物的序列为F TCR541:5'-TGCTTGAGCAGAAACAATATCAA-3'，R TCR541:5'_ TTGCGCATCTCTGTTTAGCTT-3'； b. 扩增程序：94°C预变性5min; 94°C变性30s; 60°C退火45s; 72°C延伸30s; 35个循环后； 72°(：延伸1〇11^11;最后4°(：保存； c .电泳:将扩增产物与等体积的上样缓冲液混合，94°C变性6min，之后在DNA测序电泳 仪上进行6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，70W条件下电泳2小时，电泳结束后，进行银染，并观 察扩增结果； d.判断:扩增结果中如果能够检测到252bp和大于252bp两条带，则待测材料中含有大 白菜抗根肿病基因 CRb的概率为100 %。
【文档编号】C12N15/11GK105969881SQ201610457997
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月22日
【发明人】朴钟云, 张腾, 庞文星, 李晓楠, 朴英兰, 张椿雨
【申请人】沈阳农业大学