铁皮石斛est-ssr引物组、开发方法及其在物种遗传多样性上的应用
【专利摘要】一种铁皮石斛EST?SSR引物组，其特征在于：该引物组由9对引物组成，9对引物的序列表为如下所示：具有能降低条带判读的错误或偏差，同时也能够反映出群体或个体的遗传变异、并利于功能基因的研究优点。
【专利说明】
铁皮石斛EST-SSR引物组、开发方法及其在物种遗传多样性上 的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及铁皮石斛技术领域，具体涉及一种铁皮石斛EST-SSR引物组、开发方法 及其在物种遗传多样性上的应用。
【背景技术】
[0002] 铁皮石斛（学名：Dendrobium off icinale Kimura et Migo)，又名：黑节草、仙斛 兰韵、紫萦仙株。属微子目，兰科多年生附生草本植物。茎直立，圆柱形，长9-35厘米，粗2-4 毫米，萼片和花瓣黄绿色，近相似，长圆状披针形，长约1.8cm，宽4~5mm，花期3~6月。主要 分布于中国安徽、浙江、福建等地，其茎入药，属补益药中的补阴药。我国现有的76种石斛属 植物中，具药用的就有40多种.其药理主要是强阴益精、补肾益力、明目和延年益寿。近年 来，国内对铁皮石斛资源进行了大量研究，国外，Pyati AN等对5种石斛的离体培养也获得 了一定程度的成功，但在石斛离体培养工作中，试验设计粗糙，数据缺乏可比性，对石斛离 体条件下的遗传稳定性和生理稳定性缺乏基础性研究，未能获得规范化石斛繁殖技术体系 和工艺流程，从而极大地阻碍了这一名贵中草药走向场。
[0003] 分子标记鉴定是当今流行的比传统形态鉴定方法更科学和灵敏的重要方法之一， 是构建高密度分子遗传图谱、分析物种分类与演化、染色体结构、遗传多样性、品种保护与 纯度鉴定的有效工具;但是，普通基因组SSR(gSSR)引物扩增条带稳定性较弱，不能反映出 个体或群体的遗传变异，且引物通用性较弱。EST-SSR标记不仅具有基因组SSR标记中技术 简单、重复性好、多态性高和共显性遗传等特点，还具有引物开发廉价、通用性较好、条带清 楚、容易统计等优点。此外，由于EST-SSR是编码基因的一部分，能够直接获得基因表达的相 关信息，这有可能直接鉴定决定重要表型性状的等位基因。随着NCBI中EST数据库不断地丰 富与完善，使用其序列开发SSR标记也已成为一种十分简便而有效的方法，时至今日，EST-SSR标记已在众多植物中得到广泛的应用 [6]。目前，石斛属植物的DNA分子鉴定方面主要采 用狀^)^?1^、1331?、31^?和331?等分子标记技术，如苑鹤等利用1^?0对人工栽培铁皮石斛居 群的遗传多样性进行了相关研究，发现其亲缘关系的远近与其地理种源具有显著的相关 性，而与栽培地点无关;王慧中等利用AFLP对13种石斛属植物进行了遗传多样性的分析，其 结果与传统分类学的结果基本一致;李明焱等 [9]利用ISSR进行了铁皮石斛新品种的选育 工作;樊洪泓等[1()]利用SRAP对药用石斛的遗传多样性及亲缘关系进行了相关研究;邱道寿 等对石斛属植物进行了SSR标记的开发及可转移性分析。但至目前为止，有关铁皮石斛的 EST-SSR标记却极少见于报道。本文利用本课题组前期开发的铁皮石斛EST-SSR引物用于铁 皮石斛种质资源的遗传多样性分析、种质鉴定、亲缘关系鉴定和指纹图谱构建等方面。
【发明内容】
[0004] 本发明针对现有技术的上述不足，提供一种能降低条带判读的错误或偏差，同时 也能够反映出群体或个体的遗传变异、并利于功能基因的研究的铁皮石斛EST-SSR引物。
[0005]为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种铁皮石斛EST-SSR引物 组，该引物组由9对引物组成，9对引物的序列表为如下所示(序列表SEQ ID NO. 1至SEQ ID NO. 18的核苷酸序列）：
[0015] 本发明还提供一上述铁皮石斛EST-SSR引物组的开发方法，包括：
[0016] (1)基因组DNA提取
[0017] DNA的提取采用植物/真菌基因组DNA小量提取试剂盒（上海莱楓生物科技有限公 司）提取铁皮石斛基因组DNA，Eppendorf公司生产的Bio-Photometr核酸检测仪检测DNA浓 度和纯度，根据计算所得的DNA浓度，将DNA样品溶液用TE稀释成50ng · uL-保存备 用；
[0018] (2)序列来源获得
[0019] 登录到NCBI 中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，在搜索栏中输入Dendrobium nobile(金钗石斛），得到15383条EST序列（截至2015年9月18日），利用NCBI中金钗石斛的 EST序列进行后续的SSR位点查找及其引物设计；
[0020] (3)SSR位点查找
[0021] 在线搜索软件SSRIT(Simple sequence repeat identification tool)对所有 EST序列进行SSR位点搜索(http: //www · gramene · org/db/searches/ssrtool)，搜索标准 为：二、三、四、五和六核苷酸的最小重复次数分别为10、6、5、4、3次，EST序列长度大于 100bp，SSR起始点位置距离5 '和3 '应不小于20bp。
[0022] (4)SSR引物设计
[0023]用Primer 5和Oligo 7软件进行引物设计和评价，设计引物时设置的主要参数为： GC含量40%~70%，退火温度50~62°C，引物长18~24bp，上下游引物Tm值之差应在1°C范 围之内，预期扩增产物长度100~500bp，尽量避免引物二聚体、发夹结构和错配等情况的发 生，得分超过90分方为合格，才能被用于合成、使用;共设计出合格的SSR引物有106对，引物 命名为Dn加序号，即Dn-Ι~Dn-106;
[0024] (5)EST_SSR 引物筛选
[0025] 将106对通过评估的EST-SSR引物交由上海桑尼生物科技有限公司合成。引物最适 复性温度的筛选于Eppendorf公司生产的Mastercyc 1 er普通梯度PCR仪上进行。2 X Taq PCR MasterMix购自天根生物公司（北京），PCR反应体系为20yL，其中包括：10yL的2XTaq PCR MasterMix(含有Taq酶、dNTP和优化的反应缓冲液），0.4yL的模板DNA(50ng · yL-4，0.8yL的 引物对(5μπιο1 · yL-4 X2,8yL的ddH20。反应程序为94°C预变性5min，然后进行35个循环，每 个循环包括94°C变性30s，复性（48-64°C)30s，72°C延伸30s，最后72°C延伸10min，4°C保 存。随机选择6份铁皮石斛种质资源用于引物以及最适退火温度的筛选，各引物对的最适退 火温度通过梯度PCR试验确定。筛选出有目标条带和最适退火温度的引物。
[0026]本发明还涉及一种上述的EST-SSR引物组在物种遗传多样性上的应用，比如在铁 皮石斛种质鉴定中的应用。
[0027]本发明的优点和有意效果：
[0028] 1.本发明开发的EST-SSR引物扩增出的条带为功能基因的一部分，序列相对保守， 其扩增条带结果较gSSR更稳定，这能降低条带判读的错误或偏差，同时也能够反映出群体 或个体的遗传变异，同时也利于功能基因的研究。
【附图说明】
[0029] 图1 9对引物在16份供试材料中的扩增。
[0030] 图2基于SSR结果构建的16份材料的UPGMA聚类分析
【具体实施方式】：
[0031] 下面通过实施例进一步详细描述本发明，但本发明不仅仅局限于以下实施例。 [0032] 实施例
[0033]本发明的引物组序列为：
[0043] 试验材料
[0044]本试验米集了 15份铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)种质资 源和一份串珠石斛(DO-5为串珠石斛，作为外来群，其余为铁皮石斛），D0-1采自广东饶平， D0-2采自云南思茅，D0-3采自安徽合肥，D0-4采自福建龙岩，D0-5采自浙江温州，D0-6采自 福建武夷山，D0-7采自湖南新宁崑山，D0-8采自浙江瑞安，D0-9采自浙江萧山，D0-10采自浙 江温岭雁荡山，D0-11采自云南红河，D0-12采自浙江丽水，D0-13采自云南文山，D0-14采自 浙江富阳，D0-15采自浙江临安，D0-16采自浙江富阳.具体的步骤和鉴定铁皮石斛的开发过 程为：
[0045] (1)基因组DNA提取:采用试剂盒法提取铁皮石斛基因组DNA。具体步骤如下：1.称 取兰100mg新鲜植物。
[0046] 2.将样品转入研钵中，加液氮浸没样品，然后迅速研磨，反复2-3次，研磨至细粉末 状，立即加入0.8ml Buffer PFG1和5ul RNase A1,快速研磨使Buffer PFHG1完全覆盖在样 品上，温室放置，待样品完全融化后倒入1.5ml离心管中，剧烈摇晃混合均匀。
[0047] 3.65 °C温育1小时左右，温育期间剧烈摇晃混合1-2次。
[0048] 4.冰浴2min，加入 125ul Buffer PFG2混合均匀。
[0049] 5.离心2min，仔细吸取兰700ul上清，转入干净的1.5ml离心管中。
[0050] 6.加入 125ul Buffer PFG3混合均勾，离心2min。
[00511 7.实验准备:将DNA吸附柱-C30置于收集管中并做好标记：
[0052] 在干净的1.5ml离心管中加入150ul异丙醇。
[0053] 8.吸取步骤6中5650ul上相，转入步骤7准备的已加入异丙醇的1.5ml离心管中， 缓慢吹打5次混合均匀，转入DNA吸附柱-C30。
[0054] 9.离心lmin，弃收集管，将DNA吸附柱-C30放入另外一个干净的收集管中。
[0055] 10.在DNA吸附柱-C30中加入500ul Buffer WAG，离心lmin，弃收集管，将DNA吸附 柱-C30放入另外一个干净的收集管中。
[0056] 11.在DNA吸附柱-C30中加入500ul Buffer WB1，离心lmin，弃废液，将DNA吸附柱-C30放回收集管中。
[0057] 12.重复步骤11。
[0058] 13.离心 2min。
[0059] 14.将DNA吸附柱-C30转入试剂盒携带的1.5ml离心管中，向硅胶的中央加大约 lOOulTE，将1.5ml离心管的盖子扣在DNA吸附柱上，做好标记，去除DNA吸附柱的盖子，室温 放置l-2min或者更长时间，12,000\8离心1111；[11。
[0060] 之后采用核酸检测仪检测DNA浓度和纯度，然后将DNA样品溶液用TE稀释成50ng · uL-保存备用；
[0061 ] (2)序列来源：登录到NCBI中（http://www.ncbi .nlm.nih.gov/)，在搜索栏中输入 Dendrobium officinale，仅得到800条EST序列（截至2015年9月18日），远不能满足试验要 求，故在搜索栏中输入其近缘种Dendrobium nobile(金钗石斛），得到15383条EST序列（截 至2015年9月18日），利用NCBI中金钗石斛的EST序列进行后续的SSR位点查找及其引物设 计。
[0062] (3)SSR位点查找：在线搜索软件SSRIT(Simple sequence repeat identification tool)对所有 15383条EST序列进行 SSR 位点搜索（http: // www.gramene.org/db/searches/ssrtool)，搜索标准为:二、三、四、五和六核苷酸的最小重 复次数分别为10、6、5、4、3次431'序列长度大于10(^?，338起始点位置距离5'和3'应不小于 20bp〇
[0063] (4)SSR引物设计：用Primer 5和Oligo 7软件进行引物设计和评价。设计引物时设 置的主要参数为:GC含量40%~70%，退火温度50~62°C，引物长18~24bp，上下游引物Tm 值之差应在1°C范围之内，预期扩增产物长度100~500bp，尽量避免引物二聚体、发夹结构 和错配等情况的发生，得分超过90分方为合格，才能被用于合成、使用。共设计出合格的SSR 弓丨物有106对，引物命名为Dn加序号，即Dn-Ι~Dn-106。
[0064] (5)EST-SSR引物筛选:将106对通过评估的EST-SSR引物交由上海桑尼生物科技有 限公司合成。引物最适复性温度的筛选于Eppendorf公司生产的Mastercyc 1 er普通梯度PCR 仪上进行。2XTaq PCR MasterMix购自天根生物公司（北京），PCR反应体系为20yL，其中包 括：l〇yL的2XTaq PCR MasterMix(含有Taq酶、dNTP和优化的反应缓冲液），0.4yL的模板 DNA(50ng · yL-lO.SyL的引物对（5ymol · yL-qxSjyL的ddH20。反应程序为94°C预变性 5min，然后进行35个循环，每个循环包括94°C变性30s，复性(48-64°C )30s，72°C延伸30s， 最后72°C延伸10min，4°C保存。随机选择6份铁皮石斛种质资源用于引物以及最适退火温度 的筛选，各引物对的最适退火温度通过梯度PCR试验确定。筛选出有目标条带和最适退火温 度的引物。
[0065] (6)聚丙烯酰氨凝胶电泳
[0066] 在最适退火温度下，对有目标条带的引物用于16份铁皮石斛种质资源的PCR扩增， 产物采用6%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，银染，等胶干燥后利用数码相机进行拍照、保存。 具体步骤如下：
[0067] (1)
[0068]表1 6 %聚丙烯酰胺变性凝胶制备
[0069]
[0070] 注，40%丙烯酰胺:将19(^丙烯酰胺和1(^甲叉丙烯酰胺用水稀释至50〇!^，4°(：贮 存备用。
[0071] **TEMED和25%APS在灌胶前加入。
[0072 ] (2)灌胶:轻轻灌凝胶液，防止出现气泡。聚合时间lh以上。
[0073] (3)预电泳:恒功率预电泳30min，温度达到43 °C左右。
[0074] (4)样品变性：10uL PCR样品加入5uL 3XLoading Buffer[98% 甲酰胺，0.5M EDTA(pH8.0)，0.25%溴酚蓝，0.25 %二甲苯青]，混匀后，在95°C变性5min，立即放至冰上 lOmin以上。
[0075] (5)加样和电泳:吸打加样槽，清除残胶、尿素和气泡，每一个加样孔点入5uL样品； 40_旦功率电泳约1. Oh~2.0;电泳结束后，小心分开两块玻璃板。
[0076] (6)银染程序：固定:将凝胶板置于1L乙酸溶液（10% )中，轻轻摇荡5-6min。漂洗： 用1.5L双蒸水漂洗2-3min。染色:在1.5L新配的染色液中（1.5g硝酸银，1.5mL37%甲醛），轻 轻摇荡15min。漂洗：用1.5L双蒸水漂洗，时间不超过10秒。显影:在1.5L显影液中（显影液含 无水碳酸钠45g，1 %硫代硫酸钠300uL，37 %甲醛2.25mL。提前配制，置于4 °C冰箱中预冷)轻 轻摇荡，直至出现带纹。定影:在1.5L 10%乙酸溶液中定影2-3min。漂洗：用1.5L双蒸水漂 洗2-3min。干胶:室温下自然晾干。
[0077] (7)引物多态性指标分析
[0078]铁皮石斛以富含多糖类物质而著名，其叶片多糖的含量也十分丰富，本试验所使 用的试剂盒提取基因组DNA质量较高，无其它杂质干扰，之后经核酸检测仪检测显示，OD260/ 0D 28Q值在1.68-1.95范围内，获得的DNA纯度较高，达到了后续分析的要求。最后再依据检测 出的DNA样品溶液浓度，使用预热的TE缓冲溶液稀释成30-50ng · yL-1备用。
[0079] 通过优化好的PCR反应体系对该106对EST-SSR引物进行筛选以及最佳退火温度的 筛选。在最优体系和最适退火温度下进行PCR反应，以利于高质量的聚丙烯酰胺凝胶电泳图 的获得，这保证了后续条带的统计和数据分析的准确性。
[0080] 选用16份差异较大的铁皮石斛资源的核DNA为模板对筛选过后的引物进行扩增检 测。图1为9对引物在16份供试材料中的扩增。
[0081] 由表1可知，9对引物在16份材料（图1)中共扩增出79条带，其范围为2~5条不等， 平均每条引物扩增出3.11条;其中多态性条带有23条，平均每条引物扩增出2.56条多态性 条带。平均多态性百分率为82.96%，其中DN5多态性百分率最低，为50% ;DN29、DN95和 DN106多态性百分率均为100%;其余引物多态性百分率介于50%~100%之间。
[0082] 此外，每对引物的Nei ' s基因多样度范围为0.1766~0.4297，均值为0.2855，小于 0.2的有DN23和DN60，介于0.2~0.3的有DN5、DN46和DN95，其余均大于0.3;香农信息指数范 围为0 · 2931~0 · 6211，均值为0 · 4310，小于0 · 3的有DN23和DN60，介于0 · 3~0 · 4的有DN5、 DN23和DN46，其余均大于0.4。
[0083]表2 9对引物的扩增结果
[0086] 聚类分析
[0087] 依据9对EST-SSR引物扩增结果，再利用NTSYSpc2.10e软件进行Jaccard相似性系 数分析，计算出它们之间的遗传相似系数，其中，15份铁皮石斛(去除D05)其范围在0.582~ 0.949之间，串珠石斛(D05)与15份铁皮石斛之间的范围在0.456~0.709之间（表4)。
[0088]由遗传相似系数进行UPGMA聚类分析，构建了 15份铁皮石斛和1份串珠石斛的遗传 关系图（图2)。其中在15份铁皮石斛中D08和D016号遗传相似系数最大，为0.949 ;D09和 D012、D013遗传相似系数最小，为0.582。串珠石斛(005)与008遗传相似系数最大(0.709)， 与D04遗传相似系数最小(0.456)。由图2可知，大约在遗传相似系数0.58处，串珠石斛被从 铁皮石斛中首先分1?出来;大约在遗传相似系数0.68处，15份铁皮石斛被分为3大类。
[0089] 第一类包括D09、D010、D014和D015;第二类仅包括D04;第三类包括D01、D011、D02、 D03、D07、D06、D013、D012、D08和D016。其中大约在0.77处第三类又可分为三小类，第一小类 包括D01、D011和D02;第二小类包括003、007、006、0013和0012;第三小类包括008和0016。
[0090] 结果表明，外类群-串珠石斛最先被分离出来，与15铁皮石斛遗传距离较远。来自 浙江萧山（D09)、浙江温岭雁荡山（DO 10)、浙江富阳（DO 14)和浙江临安(DO 15)亲缘关系较近 而被聚类在一起，而来自浙江瑞安(D08)和浙江富阳（D016)彼此亲缘关系最近而被聚类在 一起;来自广东饶平(D01)、云南思茅(D02)和云南红河(D011)亲缘关系较近而被聚类在一 起。以上来自相同地区或区域的基本被聚类在一起。而来自浙江丽水（D012)、云南文山 (D013)与来自安徽合肥(D03)、湖南新宁崑山（D07)和福建武夷山（D06)的亲缘关系较近而 被聚类在一起，由于目前铁皮石斛产业高度商业化，可能是人为有意、无意携带流入这些地 区造成的，亦可能是由于这些种质遗传背景比较复杂，彼此体内流着相同的"血液"，究其原 因有待后续进一步研究。总体而言，该20对引物聚类结果能够比较准确地反应种内、种间彼 此亲缘关系的远近。
[0091] 表3 16份材料SSR分析的遗传相似系数
[0093]所以，从上述应用实施例可以看出，本发明的引物可以实现对铁皮石斛的甄选、鉴 别。
【主权项】
1. 一种铁皮石解EST-SSR引物组，其特征在于：该引物组由9对引物组成，9对引物的序 列表为如下所示：2. 根据权利要求1所述的铁皮石解EST-SSR引物组的开发方法，其特征在于:包括： (1) 基因组DNA提取 DNA的提取采用植物/真菌基因组DNA小量提取试剂盒提取铁皮石解基因组DNA，检测 DNA浓度和纯度，根据计算所得的DNA浓度，将DNA样品溶液用TE稀释成50ng · uL-i，-20°C保 存备用； (2) 序列来源获得 登录到NCBI中，在捜索栏中输入Demlrobium nobile，得到15383条EST序列，利用NCBI 中金较石解的EST序列进行后续的SSR位点查找及其引物设计； (3) SSR位点查找 在线捜索软件SSRIT对所有EST序列进行SSR位点捜索，捜索标准为:二、Ξ、四、五和六 核巧酸的最小重复次数分别为10、6、5、4、3次，651'序列长度大于10化9,551?起始点位置距离 5'和3'应不小于206口。 (4) SSR引物设计 用Primer 5和Oligo 7软件进行引物设计和评价，设计引物时设置的主要参数为:GC含 量40 %~70 %，退火溫度50~62°C，引物长18~24bp，上下游引物Tm值之差应在rC范围之 内，预期扩增产物长度100~5(K)bp，尽量避免引物二聚体、发夹结构和错配等情况的发生， 得分超过90分方为合格，才能被用于合成、使用;共设计出合格的SSR引物有106对，引物命 名为Dn加序号，即Dn-1~Dn-106; 巧化ST-SSR引物筛选 将106对通过评估的EST-SSR引物交由上海桑尼生物科技有限公司合成；引物最适复性 溫度的筛选于Eppendorf公司生产的Masteixycler普通梯度PCR仪上进行；2 X Taq PCR MasterMix购自天根生物公司，PCR反应体系为20化，其中包括：10化的2XTaq PCR MasterMix，0.4化的模板DNA，0.祉L的引物对(5μπιο 1 ·化-1) X 2，祉L的d地2〇;反应程序为94 。(:预变性5min，然后进行35个循环，每个循环包括94 °C变性30s，复性30s，72 °C延伸30s，最 后72°C延伸10min，4°C保存;随机选择6份铁皮石解种质资源用于引物W及最适退火溫度的 筛选，各引物对的最适退火溫度通过梯度PC时式验确定，筛选出有目标条带和最适退火溫度 的引物。3. -种铁皮石解EST-SSR引物组在物种遗传多样性中的应用。4. 一种铁皮石解EST-SSR引物组在铁皮石解种质鉴定中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK105969872SQ201610409877
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月12日
【发明人】付涛
【申请人】宁波城市职业技术学院