利用变形梯度凝胶电泳鉴定海洋线虫的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用变形梯度凝胶电泳鉴定海洋线虫的方法，其特征是，包括以下步骤：（1）采样及室内分选；（2）形态学鉴定；（3）总DNA的提取；（4）PCR引物设计及优化；（5）琼脂糖电泳检测；（6）变性梯度凝胶的制备；（7）变性梯度凝胶电泳条件的优化；（8）运用变性梯度凝胶电泳对海洋线虫进行鉴定分析。本发明的优点如下：将DGGE技术运用到了海洋线虫的鉴定中，并运用该技术对海洋线虫的群落组成进行分析；根据特征性图谱，可获得相关线虫在变性梯度凝胶上的迁移率，可以较好的进行区分鉴定，对于难于鉴定的物种，有时需要采取两对以上的引物组合使用。
【专利说明】
利用变形梯度凝胶电泳鉴定海洋线虫的方法
技术领域
[0001] 本发明设及到海洋沉积物中海洋线虫的物种鉴定及群落组成检测的技术领域，特 别设及DGGE技术在鉴定海洋线虫中的使用方法。
【背景技术】
[0002] 小型底栖生物(meiobenthos)是一类能通过0.5mm孔经网筛，但被0.042mm网筛截 留的一类动物，其中自由生活线虫是小型底栖生物的最优势类群。在大多数生境中，海洋线 虫的数量可占整个小型底栖动物数量的70%-90%，在某些生境中可达到90%W上。海洋线虫 高度的物种多样性和丰度，表明它们是海洋中演化最成功的类群之一。运一物种在海洋沉 积物中的作用，不仅在于其数量和生物量上的优势，还在于它在食物网中与其他物种的关 系。此外，海洋线虫W其特有的生殖对策，在水层-底栖生态系统的能量转换中，在摄食和刺 激微生物的生产方面具有全球性的效应。
[0003] 海洋线虫和其他小型底栖生物类群是海洋环境质量的重要指示者，是评价群落健 康程度和环境变化的敏感指示类群。海洋线虫的物种丰富度相对稳定，生活周期短，对生态 系统的改变具有较高的适应性，并且样品的采集和处理都很简单，因此，按照水框架指令， 将其定为海洋生态监测评估体系的一个重要指标。运类生物对环境的适应度，W及对海水 污染的耐受程度和敏感程度不同，可W依据其密度、种类组成、群落结构变化对海洋底栖环 境的健康状况进行诊断。国内外已经有越来越多的学者，将海洋线虫和其它小型底栖生物 作为海洋生态监测评估体系的一个重要指标，应用于海洋环境监测中。
[0004] 对海洋线虫进行种类鉴定是线虫研究中最重要的工作之一。目前，海洋线虫的鉴 定主要是采用形态学的分析方法。运种方法W线虫的形态特征和超微结构为基础，运用显 微镜对线虫进行鉴定，是海洋线虫分类鉴定的基础。该方法可靠性强，在线虫的多样性、时 空分布等研究中一直起着不可替代的作用。但是海洋线虫微小的个体W及外部形态因发育 阶段的不同常发生很大的变化，给主要依据形态特征来鉴定的经典分类工作带来很大困 难，迫切需要新的研究手段。近些年来，现代生物学技术的迅速发展为海洋线虫的鉴定提供 了新的思路，研究者们相继从不同角度出发，利用生物化学、分子生物学等多种技术，探索 对海洋线虫的种类鉴定。
[0005] 分子多态性技术在种质鉴定中也有其独特的优势。各种多态性技术都是基于基因 组DNA水平的差异，具有检测效率高、重复性好等优点。运些分子标记技术不仅用于遗传多 样性、系统进化及分类、遗传育种的研究，还用于种质鉴定。尤其是在海洋浮游动物遗传多 样性研究的应用，将生物多样性研究从物种水平推进到了分子水平，反映更多的多态信息， 为种群遗传分化、遗传信息交流和与环境的关系提供了新的研究思路。其中，变性梯度凝胶 电泳技术(DGGE技术)不仅结果可靠、重现性好、操作简便快速，而且可W同时对大量的样品 进行分析，可W对微生物群落的动态变化进行监测，因此近年来已被广泛用于海洋生态系 统中浮游生物多样性、时空变化及物种鉴定的研究中。此外，充分了解该技术的局限性并综 合使用PCR-DGGE技术与其它生物学技术，可W更加详尽地了解微生物群落的结构及动态 变化，获得全面可靠的生物学信息，运无疑会在微生物生态学研究领域开拓一个新景象。
[0006] 青岛有机质污染带海洋线虫3个新种的描述是我国首次关于海洋线虫分类学的研 究，此后陆续有一批关于黄勸海、厦口岛、中国台湾海峡W及大亚湾等海域海洋线虫新种的 描述工作，运些为线虫的生物多样性研究奠定了很好的基础。但是目前国内研究主要是种 类调查、种群结构W及监测潮间带有机质污染等方面，并且大多都是基于传统的形态学研 究，运就需要大批海洋线虫专家，但效率低下，且数据整合也比较困难。因此，分子生物学的 鉴定方法可W对海洋线虫进行高效鉴定和分类，进而加速新种的发掘，为我国海洋生物资 源保护提供科学依据。
[0007] 综上所述，将DGGE技术运用到海洋线虫的研究中，无疑是对现有鉴定方法的很好 补充，可W解决当前线虫鉴定中存在的问题，高通量、快速、准确地进行种质鉴定及群落组 成的检测。
【发明内容】
[0008] 本发明所要解决的技术问题在于，将变形梯度凝胶电泳技术(DGGE)应用到线虫的 鉴定中，并运用该技术对线虫的群落多样性组成进行研究，为了实现上述目的，本发明提供 了一种DGGE技术在海洋线虫鉴定及多样性研究中的使用方法。
[0009] 本发明利用变形梯度凝胶电泳鉴定海洋线虫的方法，包括W下步骤： (1) 采样及室内分选 (2) 形态学鉴定 (3) 总DNA的提取 (4) PCR引物设计及优化 巧)琼脂糖电泳检测 (6) 变性梯度凝胶的制备 (7) 变性梯度凝胶电泳条件的优化 (8) 运用变性梯度凝胶电泳技术对海洋线虫进行鉴定分析。
[0010] 所述步骤(1)为:将样品于实验室内用0.1%虎红进行染色(24小时），随后用蒸馈水 进行冲洗，使样品通过孔径分别为50化m和31叫1的两层网筛，将截留在31叫1网筛上的样品， 用Ludox-TM溶液（比重为1.15)转移到离屯、管中并揽拌均匀，ISOOrmp离屯、10分钟(S次离 屯、）。将所得的上清液再用31ym的网筛过滤，去掉Ludox，将样品转移至培养皿。
[0011] 所述步骤(2)为：向盛有线虫的培养皿中加入甘油酒精水混合液(体积比分别为 5% : 5% : 90%)，放入干燥箱。大约两周后，线虫身体透明。在灭菌的载玻片上，滴甘油一 滴，挑选大小相当的线虫至甘油中。选取玻璃珠 S粒，均匀放于甘油滴的边缘，然后加盖盖 玻片，并用树胶封闭，贴标签后置于干燥箱中，待树胶干涧后即可观察。在微分干设显微镜 下进行观察和测量，依据线虫形态结构特征进行鉴定。
[0012] 所述步骤(3)为:根据样品的性质选取不同的DNA提取方法，对于酒精保存的样品 采用方法a或b，甲醒保存的样品采用方法C。
[001引（a)蛋白酶K法:挑取单条线虫，转移至预先加有5化d地20的离屯、管中，加入0.5 化10倍PCR缓冲液和0.5化蛋白酶K(20 mg/血），10 000 g 3 min充分混合，-70°C 30 min， 55°C溫浴90 min，95°C30 min(在PCR仪中进行）。制备的DNA直接用于PCR反应。
[0014] (b)碱裂解法(Bhadu巧et al.，2006a):将线虫取出，装入含有0.25 M化OH的 PCR管中，-20°C 8-9 h，60°C过夜，99°C 3 min,随后冷至室溫；16 000 g 30 S，加入4 化 1 M 肥1、10 化 0.5 M lYis-肥1 (pH 8.0)、5 化 2% Triton X-100,将混合物充分混合，16 OOOg 30 S，99°C 3 min,冷至室溫，制备的DNA可直接用于PCR反应。 (C)试剂盒提取法：按照DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Germany)的 提取方法进行提取，并将裂解时间进行优化，W便能得到高质量的DNA用于W下研究。
[0015] 所述步骤(4)为:从GenBank中下载常见优势种线虫的18S rDNA，28S rDNA及 口S区序列；运用DNAStar软件进行MegAlign分析，选择序列高变区；针对高变区两侧 的保守区用Primer premier 5.0进行引物设计;然后对所设计的引物用Oligo软件对 各参数进行评估，选出最优引物进行合成，进行PCR反应。
[0016] 所述步骤(5)为:将加1 PCR扩增的产物与lul Loading buffer混合后上样， 1%琼脂糖凝胶电泳，100V恒压电泳30min，在含0.5iig/ml EB的1XTAE缓冲液中染 色10~30min，用凝胶成像系统进行拍照。
[0017] 所述步骤(6)进一步包括垂直胶的制备(凝胶尺寸：7.5cmX lOcmX 1mm)和平行胶 的制备。
[0018] 所述步骤(7)为对变形梯度凝胶电泳的变性剂梯度及电泳时间进行优化。采用垂 直电泳对变性剂梯度进行优化，垂直电泳的电泳方向与变性剂梯度方向垂直，在低变性剂 浓度区域，样品电泳速度较快，高变性区域则相反，最终形成S形的曲线，因此当用于优化的 样品在图中呈现分开的条带时，此时所对应的变性剂浓度即为最佳变性剂浓度;采用时间 进程试验优化电泳时间，即每隔固定时间上样，看样品的分离效果，当各样品在凝胶上的条 带呈现最佳分离效果时，此时的电泳时间即为最优电泳时间。根据估算的各扩增片段低烙 解区域的烙解溫度，选取具有最高和最低烙解溫度的物种确定变性梯度，选取具有较为相 近的烙解溫度的物种进行电泳时间的优化。
[0019] 所述步骤(8)进一步包括DGGE特征性图谱的构建、条带的稳定性分析及DGGE鉴定 分析的步骤。用已经优化好的PCR条件及DGGE条件对海洋线虫进行分析，计算各种海洋线虫 每对引物扩增片段在DGGE凝胶上的迁移率。进行多样性分析，使用Quantity One软件对图 像进行处理。将图像的背景扣除后，对条带进行自动检测，然后手动进行确认。基于DGGE图 谱，采用非加权配对算数平均法（加 weighted Pair Gro叩Method with Arithmetic averages, UPGMA)聚类分析对各站位间的相似性进行分析。根据各条带的亮度，运用W下 公式计算化annon-Weaver多样性指数（H)，对各站位的物种结构多样性进行分析：H=E (m/N) In (m/N)，其中m为每条带的亮度峰值，N为每个泳道中所有条带亮度峰值的和。
[0020] 本发明的优点如下： 本发明将DGGE技术运用到了海洋线虫的鉴定中，并运用该技术对海洋线虫的群落组成 进行分析，主要如下： (1)本发明分别针对核糖体基因序列的18S rDNA、28S rDNA及ITS区序列设计引物，进 行PCR条件优化，通过垂直电泳和时间进程实验进一步优化DGGE电泳条件，从而获得海洋线 虫的特征性条带，进而建立特征性图谱，为海洋线虫的鉴定提供了一种新的手段。
[0021] (2)本发明根据特征性图谱，可获得相关线虫在变性梯度凝胶上的迁移率，可W较 好的进行区分鉴定，对于难于鉴定的物种，有时需要采取两对w上的引物组合使用。
[0022] (3)运用DGGE技术对海洋线虫的多样性进行分析，基于DGGE图谱的相似性进行聚 类分析，并运用运用典范对应分析(Canonical Correspondence Analysis, CCA)对群落多 样性与理化因子的关系进行探讨，了解环境因子对海洋线虫群落组成的影响。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合实施例对本发明作进一步解释。
[0024] 参考文献：Diez B.,化dros-Alio C. , Marsh T. L. , et al. Application of denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) to study the diversity of marine picoeukaryotic assemblages and comparison of DGGE with other molecular techniques. Applied and Environmental Microbiology, 2001, 67(7): 2942-2951. 实施例利用变形梯度凝胶电泳鉴定海洋线虫的方法，包括W下步骤： (9) 采样及室内分选 (10) 形态学鉴定 (11) 总DNA的提取 (12) PCR引物设计及优化 (13) 琼脂糖电泳检测 (14) 变性梯度凝胶的制备 (15) 变性梯度凝胶电泳条件的优化 (16) 运用变性梯度凝胶电泳技术对海洋线虫进行鉴定分析。
[0025] 所述步骤（1)为:将样品于实验室内用0.1%虎红进行染色(24小时），随后用蒸馈水 进行冲洗，使样品通过孔径分别为50化m和31叫1的两层网筛，将截留在31叫1网筛上的样品， 用Ludox-TM溶液（比重为1.15)转移到离屯、管中并揽拌均匀，ISOOrmp离屯、10分钟(S次离 屯、）。将所得的上清液再用31ym的网筛过滤，去掉Ludox，将样品转移至培养皿。
[0026] 所述步骤(2)为：向盛有线虫的培养皿中加入甘油酒精水混合液(体积比分别为 5% : 5% : 90%)，放入干燥箱。大约两周后，线虫身体透明。在灭菌的载玻片上，滴甘油一 滴，挑选大小相当的线虫至甘油中。选取玻璃珠 S粒，均匀放于甘油滴的边缘，然后加盖盖 玻片，并用树胶封闭，贴标签后置于干燥箱中，待树胶干涧后即可观察。在微分干设显微镜 下进行观察和测量，依据线虫形态结构特征进行鉴定。
[0027] 所述步骤(3)为:根据样品的性质选取不同的DNA提取方法，对于酒精保存的样品 采用方法a或b，甲醒保存的样品采用方法C。
[002引（d)蛋白酶K法:挑取单条线虫，转移至预先加有5化d地20的离屯、管中，加入0.5 化10倍PCR缓冲液和0.5化蛋白酶K(20 mg/血），10 000 g 3 min充分混合，-70°C 30 min， 55°C溫浴90 min，95°C30 min(在PCR仪中进行）。制备的DNA直接用于PCR反应。
[0029] (e)碱裂解法(Bhadu巧et al.，2006a):将线虫取出，装入含有0.25 M化0H的 PCR管中，-20°C 8-9 h，60°C过夜，99°C 3 min,随后冷至室溫；16 000 g 30 S，加入4 化 1 M 肥1、10 化 0.5 M lYis-肥1 (pH 8.0)、5 化 2% Triton X-100,将混合物充分混合，16 OOOg 30 S，99°C 3 min,冷至室溫，制备的DNA可直接用于PCR反应。 (f)试剂盒提取法：按照DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Germany)的 提取方法进行提取，并将裂解时间进行优化，W便能得到高质量的DM用于W下研究。
[0030] 所述步骤(4)为:从GenBank中下载常见优势种线虫的18S rDNA，28S rDNA及 口S区序列；运用DNAStar软件进行MegAlign分析，选择序列高变区；针对高变区两侧 的保守区用Primer premier 5.0进行引物设计;然后对所设计的引物用Oligo软件对 各参数进行评估，选出最优引物进行合成，进行PCR反应。
[0031] 本专利所用引物
a 在引物的 5'端加一个 40 bp 的 GC 夹，序列为 CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGG GGCACGGGGGG b 在引物的 5'端加一个 40bp 的 GC 夹，序列为 CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCG TCCCGCCGCCCCCGCCCG PCR 反应体系（50ul)包括：约 50ng 模板 DNA，200咖 dNTP，1.5mM MgC12,0.3iiM 引物，2.5 U Ex TagDNA polymerase (hKaRa), IXEx Taq Buffer。（1)引物 E址lA ~Euk516的PCR反应程序为：94°C，变性130 s; 94°C，变性30 s，58°C，退火45 s， 35 个循环；72°C，延伸 130 s，72°C，延伸 10 min。
[0032] (2)引物 Eukl209~1649R 的 PCR 反应采用降落 PCR: 94°C，变性 4 min; 94 °(：，变性1111111，67~57°(：，退火1111111，10个循环(每个循环降低1°(：);72°(：，延伸3 min，94°C，变性 1 min，57°C，退火 1 min, 20 个循环；72°C，延伸 3 min，72°C，延伸 10 min。（3)引物 28SD1F~28SD1R 的 PCR 反应采用降落 PCR: 94°C，变性 4 min; 94 °(：，变性1111111，48~43°(：，退火1111111，10个循环（每个循环降低1°(：);72°(：，延伸1 min，94°C，变性 1 min,43°C，退火 1 min,20 个循环；72°C，延伸 1 min，72°C，延伸 10 min〇
[0033] 所述步骤(5)为:将加1 PCR扩增的产物与lul Loading buffer混合后上样， 1%琼脂糖凝胶电泳，lOOV恒压电泳30min，在含0.5iig/ml EB的IXTAE缓冲液中染 色10~30min，用凝胶成像系统进行拍照。
[0034] 所述步骤(6)进一步包括垂直胶的制备(凝胶尺寸：7.5cmX lOcmX 1mm)和平行胶 的制备，垂直胶具体制备步骤如下， 用洗涂剂彻底擦洗玻璃板，先用自来水冲洗干净，后用双蒸水冲洗=遍，惊干； 取相同厚度的隔板，带槽的一侧面向大玻璃板，两个隔板的凹面相对应;插入梳子，两 侧及中间的隔板与玻璃板底部平齐； 垂直放置制胶板系统，松梳子衬垫系统的螺丝，将两系统放置至两者刚好完全匹配，梓 衬垫系统的螺丝直到碰到玻璃板，再梓1/4圈； 平放压力夹，松螺丝;带螺丝的一面朝下，出气口一面朝上； 将压力夹放置于制胶板系统中间位置，梓压力夹的螺丝直到碰到梳子衬垫系统，再梓 两圈； 再梓梳子衬垫系统的螺丝一圈，移走压力夹； 按上旋塞，将海绵垫放在制胶架上，把制胶板系统(一定要用校正板进行校正，W免漏 胶)垂直放在海绵上方并固定好，将短玻璃的一面对着自己； 一边梓开旋塞，打开出气口，另一侧关上;将倾斜杆调到最高的刻度线处；用梯度传送 系统将凝胶注入到两玻璃板之间，保证整个过程要恒定匀速且缓慢； 灌胶完毕后，关上旋塞和出气口，将倾斜杆放平； 聚合60min后，取下梳子衬垫系统，在另一侧添加含有催化剂的丙締酷胺溶液，聚合 60min，此时打开循环累及加热器，预热电泳缓冲液到60°C，迅速清洗用完的设备。
[0035] 聚合完毕后拔走梳子，将胶放入到电泳槽内，用双蒸水清洗点样孔=次，随后加 样； 20V预电泳lOmin，随后按照优化的电泳参数进行电泳。
[0036] 电泳完毕后，先拨开一块玻璃板，然后将胶放入盘中。用去离子水冲洗，使胶和玻 璃板脱罔； 倒掉去离子水，将胶放入0.扣g/ml的邸溶液中，摇床上摇荡染色15min; 凝胶成像系统拍照。
[0037] 所述平行胶的制备方法如下(凝胶尺寸：16cm X 16cm X 1mm): 用洗涂剂彻底擦洗玻璃板，先用自来水冲洗干净，后用双蒸水冲洗=遍，惊干； 将海绵垫放在制胶架上，把制胶板系统(一定要用校正板进行校正，W免漏胶)垂直放 在海绵上方并固定好，将短玻璃的一面对着自己； 将两根长的聚乙締细管（15.5cm)分别连上30ml注射器，短的(9cm)聚乙締细管连于Y形 S通的一端； 在两个注射器上分别标记"高浓度"与"低浓度"，并安装上相关的配件，调整梯度传送 系统的刻度到适当的位置:本试验中使用的为16cmX16cmX 1mm的胶板，调整装置到体积刻 度为14.5处； 分别将15ml两种变性浓度的丙締酷胺溶液倒入两个塑胶管中，每管加入15iU TEMED (l/1000)，150iil 10%APS(1 /100)，颠倒数次混匀，吸入到标有浓度的注射器中； 分别将标有高浓度和低浓度的注射器正确安装在梯度传送系统上，再将注射器的聚丙 締管连于Y形=通； 用梯度传送系统将凝胶注入到两玻璃板之间，保证整个过程要恒定匀速且缓慢； 小屯、斜插入梳子，凝胶聚合大约两小时;待胶凝固一小时后，打开循环累及加热器，预 热电泳缓冲液到60°C，迅速清洗用完的设备。
[0038] 所述步骤(7)为对变形梯度凝胶电泳的变性剂梯度及电泳时间进行优化。采用垂 直电泳对变性剂梯度进行优化，垂直电泳的电泳方向与变性剂梯度方向垂直，在低变性剂 浓度区域，样品电泳速度较快，高变性区域则相反，最终形成s形的曲线，因此当用于优化的 样品在图中呈现分开的条带时，此时所对应的变性剂浓度即为最佳变性剂浓度;采用时间 进程试验优化电泳时间，即每隔固定时间上样，看样品的分离效果，当各样品在凝胶上的条 带呈现最佳分离效果时，此时的电泳时间即为最优电泳时间。根据估算的各扩增片段低烙 解区域的烙解溫度，选取具有最高和最低烙解溫度的物种确定变性梯度，选取具有较为相 近的烙解溫度的物种进行电泳时间的优化。
[0039] 分别采用垂直电泳及时间进程试验对DGGE的变性梯度和电泳时间进行优化，具体 电泳所用参数如下表： DG(iE优化的电泳条件*
*电泳溫度均为60°C 所述步骤(8)进一步包括DGGE特征性图谱的构建、条带的稳定性分析及DGGE鉴定分析 的步骤。用已经优化好的PCR条件及DGGE条件对海洋线虫进行分析，计算各种海洋线虫每对 引物扩增片段在DGGE凝胶上的迁移率。进行多样性分析，使用Quantity One软件对图像进 行处理。将图像的背景扣除后，对条带进行自动检测，然后手动进行确认。基于DGGE图谱，采 用非加权配对算数平均法(Unwei曲ted Pair Group Method with Arithmetic averages, UPGMA)聚类分析对各站位间的相似性进行分析。根据各条带的亮度，运用W下公式计算 Shannon-Weaver多样性指数(H)，对各站位的物种结构多样性进行分析:H=E (m/N) In (m/N)，其中m为每条带的亮度峰值，N为每个泳道中所有条带亮度峰值的和。
[0040] 具体实施方法如下： a. 海洋线虫特征性图谱的构建 运用 BioNumerics (BN)软件（Applied Maths, St.-Ma;rtens-Latem, Belgium)对 DGGE图谱进行分析，用优化好的DGGE电泳条件对所研究线虫的每对引物扩增片段进行电 泳，从而获得特征性图谱库。得到各种线虫每对引物扩增片段在DGGE凝胶上的迁移率，迁 移率公式如下：Rf=畑/LX 100%(畑为点样孔到目的片段的距离，L为整块凝胶的长度） b. 条带稳定性分析方法选取所研究海域优势种线虫如化JcAoJaimt/s sinensis、 AfetoncAoJaimusmoJesvI/etacAromac/ora sp.等，采用引物 28SD1F~28SD1R 按照已经建 立的DGGE方法，对W上实验再做两次重复，比较不同批次电泳之间存在的误差大小，确定 条带的稳定性。
[0041 ] C.目标线虫的DGGE鉴定 取待鉴定线虫，进行DNA提取及PCR扩增，将PCR扩增产物用W上优化所得DGGE电泳条件 进行电泳，获得DGGE条带的迁移率，将该迁移率与已建立的DGGE特征性图谱库中的数据进 行对比，W此鉴定线虫。
[0042]本发明的完成得益于山东省自然科学基金(ZR2014DM008)和聊城大学博±基金 (3180500)资助。
【主权项】
1. 利用变形梯度凝胶电泳鉴定海洋线虫的方法，其特征是，包括以下步骤：（1)采样及 室内分选；（2)形态学鉴定；（3)总DNA的提取；（4)PCR引物设计及优化；（5)琼脂糖电泳检测； (6)变性梯度凝胶的制备；（7)变性梯度凝胶电泳条件的优化；（8)运用变性梯度凝胶电泳对 海洋线虫进行鉴定分析。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述步骤（1)为:将样品于实验室内用0.1%虎 红进行染色(24小时），随后用蒸馏水进行冲洗，使样品通过孔径分别为500μπι和31μπι的两层 网筛，将截留在31μπι网筛上的样品，用Ludox-TM溶液（比重为1.15)转移到离心管中并搅拌 均勾，1800rmp离心10分钟(三次离心）；将所得的上清液再用31μηι的网筛过滤，去掉Ludox， 将样品转移至培养皿。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述步骤(2)为：向盛有线虫的培养皿中加入 甘油酒精水混合液(体积比分别为5% : 5% : 90%)，放入干燥箱;两周后，线虫身体透明；在 灭菌的载玻片上，滴甘油一滴，挑选大小相当的线虫至甘油中；选取玻璃珠三粒，均匀放于 甘油滴的边缘，然后加盖盖玻片，并用树胶封闭，贴标签后置于干燥箱中，待树胶干涸后观 察;在微分干涉显微镜下进行观察和测量，依据线虫形态结构特征进行鉴定。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述步骤(3)为:根据样品的性质选取不同的 DNA提取方法，对于酒精保存的样品采用方法a或b，甲醛保存的样品采用方法c: 蛋白酶K法:挑取单条线虫，转移至预先加有5 yL ddH20的离心管中，加入0.5 yL10倍 PCR缓冲液和0.5 yL蛋白酶K(20 mg/mL)，10000 g 3 min充分混合，-70°C 30 min，55°C温 浴90 min，95°C30 min(在PCR仪中进行）；制备的DNA直接用于PCR反应； 碱裂解法（Bhadury et al·，2006a):将线虫取出，装入含有0.25 M NaOH的PCR管 中，-20°C 8-9 h，60°C过夜，99°C 3 min，随后冷至室温；16000 g 30 S，加入4 yL 1 Μ HC1、10 yL 0.5 M Tris-HCl (pH 8·0)、5 yL 2% Triton Χ-100,将混合物充分混合，16 000g 30 S，99°C 3 min，冷至室温，制备的DNA直接用于PCR反应； 试剂盒提取法：按照DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Germany)的提 取方法进行提取，并将裂解时间进行优化，以得到高质量的DNA用于研究。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述步骤(4)为:从GenBank中下载常见优 势种线虫的18S rDNA，28S rDNA及ITS区序列；运用DNAStar软件进行MegAlign分 析，选择序列高变区；针对高变区两侧的保守区用Primer premier 5.0进行引物设计； 然后对所设计的引物用Oligo软件对各参数进行评估，选出最优引物进行合成，进行PCR 反应。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述步骤(5)为:将5ul PCR扩增的产物与 lul Loading buffer混合后上样，1%琼脂糖凝胶电泳，100V恒压电泳30min，在含0.5 μg/ml EB的1XTAE缓冲液中染色10~30min，用凝胶成像系统进行拍照。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述步骤(6):包括垂直胶的制备(凝胶尺寸： 7 · 5cm X 10cm X 1mm)和平行胶的制备。8. 根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述步骤(7)为对变形梯度凝胶电泳的变性 剂梯度及电泳时间进行优化;采用垂直电泳对变性剂梯度进行优化，垂直电泳的电泳方向 与变性剂梯度方向垂直，在低变性剂浓度区域，样品电泳速度较快，高变性区域则相反，最 终形成S形的曲线，当用于优化的样品在图中呈现分开的条带时，此时所对应的变性剂浓度 即为最佳变性剂浓度;采用时间进程试验优化电泳时间，即每隔固定时间上样，看样品的分 离效果，当各样品在凝胶上的条带呈现最佳分离效果时，此时的电泳时间即为最优电泳时 间；根据估算的各扩增片段低熔解区域的熔解温度，选取具有最高和最低熔解温度的物种 确定变性梯度，选取具有较为相近的熔解温度的物种进行电泳时间的优化。9.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述步骤(8)进一步包括DGGE特征性图谱的 构建、条带的稳定性分析及DGGE鉴定分析的步骤;用已经优化好的PCR条件及DGGE条件对海 洋线虫进行分析，计算各种海洋线虫每对引物扩增片段在DGGE凝胶上的迀移率;进行多样 性分析，使用Quantity One软件对图像进行处理;将图像的背景扣除后，对条带进行自动检 测，然后手动进行确认；基于DGGE图谱，采用非加权配对算数平均法（Unweighted Pair Group Method with Arithmetic averages, UPGMA)聚类分析对各站位间的相似性进行分 析;根据各条带的亮度，运用以下公式计算Shannon-Weaver多样性指数(H)，对各站位的物 种结构多样性进行分析:Η=Σ (m/N) In (m/N)，其中m为每条带的亮度峰值，N为每个泳 道中所有条带亮度峰值的和。
【文档编号】C12Q1/68GK106048047SQ201610557840
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月15日
【发明人】孙静
【申请人】聊城大学