结直肠癌环状rna分子标记物及检测试剂的制作方法
【专利摘要】本发明公开了结直肠癌环状RNA分子标记物及检测试剂，该环状RNA分子标记物为hsa_circ_002146，hsa_circ_002146RNA在结直肠癌中明显低于癌旁组织，可以作为结直肠癌的分子标记物；该分子标记物的检测试剂为一对特异性引物：TGAAGAGCAT TCCAGATC和TCCTTCCTAC ACCCTACT，该检测试剂可以特异性检测出结直肠癌的hsa_circ_002146RNA明显低于癌旁组织，若hsa_circ_002146基因片段低水平表达，且表达倍数低于0.545，则认为结直肠癌，该基因检测试剂具有特异、灵敏、快速和检测简单方便、针对性强的优点。
【专利说明】
结直肠癌环状RNA分子标巧物及检测试剂
技术领域
[0001] 本发明设及结直肠癌分子标记物及检测试剂，具体设及结直肠癌环状RNA分子标 记物及检测试剂。
【背景技术】
[0002] 结直肠癌近年来的发病率有明显上升趋势，结直肠癌的患者的术后生存情况有了 较大的改善，但是结直肠癌患者的五年总体生存率仍旧不高，其中最重要的一个因素就是， 在结直肠癌患者在疾病发生的早期没有得到及时的诊断和治疗。现用于诊断消化系统中恶 性肿瘤的方法主要包括消化内镜检查，影像学检查，生化和免疫学检查及基因诊断。免疫学 检查结直肠癌的标记物主要有〔419-9、〔64、？53、1(-阿3等，但对早期诊断的价值有限。因此 如授权公告号为CN103740854R的发明专利，就公开了结直肠癌标记物CystatinSN、 切statinS和切statinSA蛋白的检测试剂，该半脫氨酸蛋白酶抑制剂的检测试剂可W用于 结直肠癌的早期诊断，癌变组织和癌旁组织的表达差异非常明显。但目前结直肠癌标分子 记物基本都是蛋白层面的研究和应用，其免疫学检测手段繁琐，费时费力，成本高，效益低， 且结果不显著。基因层面的环形RNA(circRNA)是新近确认的一类特殊的非编码RNA，是RNA 剪接后所形成的一类极稳定的保守型产物，circRNA可作为miRNA海绵来影响基因的调控与 表达，通过与疾病关联的miRNA相互作用，在疾病中发挥着重要的调控作用。有研究人员发 现circRNA在动脉粥样硬化、神经系统素乱、糖尿病和肿瘤等疾病发生过程中发挥着非常 重要的作用。目前，已有研究证实CircRNA在胃癌和非癌组织的表达量存在显著差异，是临 床上具有潜在诊断价值的新型生物标志物。但是目前，国内外还没有公开任何关于利用 circRNA分子作为检测结直肠癌预测或诊断的分子标志物来检查结直肠癌的相关研究报 道。
【发明内容】
[0003] 本发明所要解决的技术问题是提供一种结直肠癌环状RNA分子标记物及检测试 剂，该环状RNA分子标记物为hsa_circ_002146，其检测试剂具有检测灵活快速，简单方便， 针对性强的优点。
[0004] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:结直肠癌环状RNA分子标记物，该 环状RNA分子标记物为hsa_ci;rc_002146。
[0005] 该结直肠癌环状RNA分子标记物的检测试剂为一对特异性引物，该对特异性引物 的核巧酸序列如下： 上游引物的核巧酸序列为:5'- TGAAGAGCAT TCCAGATC -3'， 下游引物的核巧酸序列为:5'- TCCTTCCTAC ACCCTACT -3'。
[0006] 与现有技术相比，本发明的优点在于结直肠癌环状RNA分子标记物及检测试剂，该 环状RNA分子标记物为hsa_ci;rc_002146，hsa_ci;rc_002146RNA在结直肠癌中明显低于癌旁 组织，可W作为结直肠癌的分子标记物；该分子标记物的检测试剂为一对特异性引物： TGAAGAGCAT TCCAGATC和TCCTTCCTAC ACCCTACT，该检测试剂可W特异性检测出结直肠癌的 hsa_circ_002146RNA明显低于癌旁组织，若hsa_circ_002146基因片段低水平表达，且表达 倍数低于0.545,则认为结直肠癌，该基因检测试剂具有特异、灵敏、快速和检测简单方便、 针对性强的优点。
【具体实施方式】
[0007] W下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
[000引实施例1 结直肠癌环状3歴分子标记物，该环状1?歴分子标记物为1133_(3；[1'(3_002146，是在 CircBase 数据库（http: //circbase. org/cgi-bin/simplesearch. cgi)中获得hsa_circ_ 002146RNA序列，并且利用生物信息学方法分析和大量病例研究获得其与结直肠癌密切相 关，在结直肠癌的表达明显低于正常组织。该结直肠癌环状RNA分子标记物的检测试剂为一 对特异性引物:5'- TGAAGAGCAT TCCAGATC -3'和5'- TCCTTCCTAC ACCCTACT -3'，该对引 物是通过对环状RNA hsa_circ_002146的环化位点的研究、分析和设计引物，并通过试验、 筛选最终获得该对引物，引物由上海生功生物工程股份有限公司合成。
[0009] 实施例2 利用实施例1的一对引物进行病例检测，具体检测过程如下： 1、DNA提取:我们从宁波市医疗中屯、李惠利医院采集5例结直肠癌新鲜组织样本和对应 的癌旁组织样本，采用TRIZ0L试剂（Invitrogen Life Technologies Co, USA)按照说明 书提取组织总RNA,通过化noDropSOOO超微量分光光度计（Thermo Fisher Scientif ic， USA)检测所得RNA的浓度及纯度，然后将总RNA用GoScript Reverse lYanscription (RT) System试剂盒（购于美国Promega公司）按照说明书反转录成cDNA，cDNA用无酶水稀释4倍 得到cDNA样本。
[0010] 2、PCR反应：取4ul cDNA样本溶液加入到lOul Roche lightCycler 480 SYBR GREENIMaster混合液(购于美国Roche公司）中，再加入1.6 ul特异性上、下游引物（上、下 游引物浓度都为l〇pmol/ul)，4.4ul无 RNA酶水，组成20 ul反应体系在罗Roche li曲t切cler 480 n仪器上进行PCR扩增反应;扩增步骤包括初始激活在94°C，10分钟;94°C 20 s，55°C 30 s，72°C 30 S，共进行45次循环的退火反应;反应完成后是95°C Imin，59°C 30s，95°C 30s进入烙解曲线分析，判断产物的特异性。
[OOW 3、完毕后PCR产物测序，结果比对后为目的片段，该目的片段包含hsa_circ_ 002146环化位点，为hsa_circ_002146特异性片段。采用方法对数据进行整理分析结 果发现:被检测的患者RNA hsa_circ_002146在结直肠癌中与配对正常组织中表达差异下 调，若hsa_circ_002146基因片段低水平表达，且表达倍数低于0.545(代替特异性上、下游 引物的内参基因 GAPDH扩增正向引物序列：5 ' -AGTAGAGGCAGGGATGATG-3 '，反向引物序列： 5' -TGGTATCGTGGAAGGACTC-3 '，购于上海生功，检测方法同上），则认为结直肠癌，如表1结直 肠癌癌变组织与癌旁组织的hsa_circ_002146RNA表达存在显著差异。 「00121 亲1 .痛巧巧饭甚巧占痛宰巧饭的Visa
m'rr. n〇214fiRNA姑对亲化hk妖亲
从表1中可W看出，在结直肠癌病症患者中，通过hsa_circ_002146RNA的检测试剂检 ，其癌变组织的hsa_circ_002146RNA表达明显低于癌旁组织的hsa_circ_002146RNA表 达。
【主权项】
1. 结直肠癌环状RNA分子标记物，其特征在于该环状RNA分子标记物为hsa_circ_ 002146〇2. 权利要求1所述的结直肠癌环状RNA分子标记物的检测试剂，该结直肠癌环状RNA分 子标记物的检测试剂为一对特异性引物，其特征在于该对特异性引物的核苷酸序列如下： 上游引物的核苷酸序列为:TGAAGAGCAT TCCAGATC， 下游引物的核苷酸序列为:TCCTTCCTAC ACCCTACT。
【文档编号】C12N15/11GK106048036SQ201610518307
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月5日
【发明人】周重昌, 李锦芸, 包天链, 高腾蛟
【申请人】周重昌