一种基于甲基化环状dna分子的突变方法
【专利摘要】本发明涉及一种基于甲基化环状DNA分子的突变方法：a）PCR反应获得带有特定突变的环形单链DNA：以甲基化环状DNA为模板，使用带突变位点的突变引物，采用高保真的耐热DNA聚合酶和高温DNA连接酶进行扩增；b）将步骤a）的PCR产物使用限制性内切酶DpnI消化，去除甲基化模板；c）将步骤b）中的消化产物转入感受态细胞中，所述的带有特定突变的环状单链DNA修复为带有特定突变的环状双链DNA，最终得到突变后的质粒。本发明的方法可实现一步多点突变，且操作简单，突变率高，单点突变阳性率95%以上，相距1kb以上两点、三点突变阳性率在60%以上。
【专利说明】-种基于甲基化环状DNA分子的突变方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学【技术领域】，具体地说，涉及一种基于甲基化环状DNA分子 的突变方法。
【背景技术】
[0002] 体外定点突变技术是当前生物、医学各领域研究中的一种重要实验手段，是改造、 优化基因的便捷方案，是探索启动子调节位点的有效手段，也是研究蛋白质结构和功能之 间的复杂关系的有力工具。
[0003] 对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基 酸序列和蛋白质结构，进而改变蛋白质的功能。定点突变技术的潜在应用领域很广，比如 研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，改造启动子或者DNA 作用元件，引入新的酶切位点，提高蛋白的抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结 构，以及药物研发、基因治疗等方面。目前定点突变方法主要有寡核苷酸引物介导的定点突 变、PCR介导的定点突变、盒式突变。
[0004] 寡核苷酸引物介导的定点突变，首先要把含有待突变的DNA片段克隆到M13噬菌 体载体中。M13噬菌体的正链可以去感染具有性纤毛的细菌，并在细菌体内进行复制后，以 出芽的形式形成新的带有正链DNA的噬菌体。而留存在噬菌体内的则是双链状态的复制性 M13,受M13感染的细菌生长减慢，在细菌培养皿上会形成透明的噬菌斑。将目的DNA插入 到复制型M13的多克隆位点上，去转染细菌，提取单链DNA作为突变的模板。根据需要合成 带有突变核苷酸序列的寡聚核苷酸引物，使之与带有目的DNA的单链M13模板杂交，然后加 入DNA聚合酶和四种脱氧核糖核苷酸，使杂交上的突变引物得以延伸，并用DNA连接酶使新 合成的DNA成环，再去转染细菌。可用DNA序列分析方法从得到的噬菌体中筛选出带有突 变DNA相应的片段，从而得到完整的DNA突变体。
[0005] PCR介导的定点突变是利用四种引物，进行三轮的PCR反应，其中头两轮分别扩增 出彼此重叠的DNA片段，第三轮PCR使这两条片段融合起来。它在前两轮的PCR中，应用两 个互补的并在相同部位具有相同碱基突变的内侧引物，扩增形成两条有一端可彼此重叠的 双链DNA片段，两者在其重叠区段具有相同的突变。由于具有重叠的序列，所以在去除了未 参入的多余引物后，这两条双链DNA片段经变性和退火处理，便可能形成两种不同形式的 异源双链分子。其中一种具5'凹陷末端的双链分子，不能作为TaqDNA聚合酶的底物；另一 种具有3'凹陷末端的双链分子，可通过TaqDNA聚合酶的延伸作用，产生出具两重叠序列的 双链DNA分子。这种DNA分子再用两个外侧寡核苷酸引物进行第三轮PCR扩增，偏可产生 出一种突变位点远离片段末端的突变体DNA。
[0006] 盒式突变是利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基 因中的相应序列。这种突变的寡核苷酸是由两条寡核苷酸组成的，当它们退火时，按设计要 求产生克隆需要的粘性末端，由于不存在异源双链的中间体，因此重组质粒全部是突变体。 如果将简并的突变寡核苷酸插入到质粒载体分子上，在一次的实验中便可以获得数量众多 的突变体，大大减少了突变需要的次数。
[0007] 三种方法各有优点，寡核苷酸介导的方法保真度高；PCR介导的方法操作简单，突 变成功率高；盒式方法简单易行，突变效率高。但它们也各自存在着很大的缺点，寡核苷酸 介导的方法操作复杂，周期长；PCR介导的方法后续工作复杂，TaqDNA聚合酶保真性低；盒 式方法需合成多条引物成本高，受到酶切位点的限制。
[0008] 综上所述，亟需一种操作简单、保真性好，且能实现一步多点突变的方法，但是目 前关于这种方法还未见报道。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种基于甲基化环状DNA分子的突 变方法。
[0010] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是： 一种基于甲基化环状DNA分子的突变方法，包括以下步骤： a) PCR反应获得带有特定突变的环形单链DNA :以甲基化环状DNA为模板，使用带突变 位点的突变引物，采用高保真的耐热DNA聚合酶和高温DNA连接酶进行扩增； b) 将步骤a)的PCR产物使用限制性内切酶Dpn I消化，去除甲基化模板； c) 将步骤b)中的消化产物转入感受态细胞中，所述的带有特定突变的环状单链DNA修 复为带有特定突变的环状双链DNA，最终得到突变后的质粒。
[0011] 步骤a)中，所述的高保真的耐热DNA聚合酶为Phusion High-Fidelity DNA Polymerase。
[0012] 所述的高保真的耐热DNA聚合酶与高温DNA连接酶的添加比例为：酶活力单位 比 1 :60。
[0013] 所述的高温DNA连接酶为Taq DNA Ligase连接酶或9° N DNA连接酶。
[0014] 所述的突变引物是以甲基化环状DNA为模板设计的单条引物，在突变位点前后各 保留16~20个与模板配对的碱基。
[0015] 步骤b)中，使用限制性内切酶Dpn I消化的时间为5分钟至过夜。
[0016] 步骤c)中，所述的消化产物是直接转入感受态细胞中。
[0017] PCR反应的体系中还包含反应缓冲液、GC反应缓冲液、dNTP、ATP、NAD+。
[0018] 需要说明的是，本发明中，PCR反应的模板一定要甲基化，若非甲基化的DNA模板， 可先转化dam +的大肠杆菌菌株再抽提获得；尽量采用高纯度、浓度大约为50?100 ng/ μ 1的质粒；若模板大于15 kb，需将所需突变序列亚克隆到较小的载体中实施。所述的 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase其保真性能和扩增效率俱佳。
[0019] 本发明优点在于：本发明的方法不但具有普通定点突变的功能，而且当遇到多个 位点突变的需求时，也可以实现一步多点突变，解决了普通单点突变只能对目标位点逐一 引入突变，耗时费力的问题，且操作简单，突变率高，单点突变阳性率95%以上，相距Ikb以 上两点、三点突变阳性率在60%以上。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 附图1是本发明的原理与操作简示图。
[0021] 附图2是实施例1中氨基酸突变后的3个单菌落测序比对结果图。
[0022] 附图3是实施例1中氨基酸突变3菌落测序原始峰图。 附图4是引物设计举例。 附图5是引物设计前原始模板序列及设计后突变引物序列比对图。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合附图对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0024] 本发明技术方案的总体思路为：制备甲基化模板，针对每一个目标突变只合成一 条突变引物，再利用保真性能和扩增效率俱佳的耐热DNA聚合酶，快速合成与模板互补的 带有特定突变的环状单链DNA (30 sec/1 kb)，最大限度地保持扩增质粒的保真性，大大缩 短反应时间。经过多个PCR循环反应后，带有特定突变的环状单链DNA数目成倍增长。PCR 反应结束后，采用限制性内切酶Dpn I消化甲基化的模板，而带有突变的环状单链DNA则通 过转化大肠杆菌体，在其体内修复为环状双链DNA，最终得到带有突变组的DNA质粒。
[0025] 一、试剂准备 1、突变混合酶的配制：2 U/μΙ Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (NEB M0530)与 4〇υ/μ I Taq DNA Ligase 连接酶 （NEB M0208)或者 40U/μ I 9。N DNA 连 接酶（NEB M0238)按照体积比1:3配制，如果配制10次的突变酶用2. 5μ 1的Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 加上7· 5μ1 的Taq DNA Ligase 连接酶或者 9。N DNA 连 接酶。
[0026] 2、突变 dNTP 配制：10mM dNTP Mix (EXCELL ΜΒ021-0014) 2· 5μ 1，50 μΜ β-Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) (NEB Β9007)5μ1，灭菌双蒸水 2·5μ I; 或者 IOmM dNTP Mix (EXCELL ΜΒ021-0014) 2·5μ1，10 μΜ ΑΤΡ(ΝΕΒ Ρ0756)5μ1，灭菌双 蒸水2. 5 μ 1。
[0027] 3、突变 buffer 用 Phusion 酶自带的 5 XBuffer。
[0028] 4、模板消化用酶用 FastDigest Dpn I (MBI FD1704)。
[0029] 二、模板准备 1)请使用15 kb以下的质粒作为模板；如果模板质粒过大，可将所需突变的序列亚克 隆到较小的载体中，完成突变后再克隆到目的载体中；或者在将近对称位置设计一条与模 板完全互补的引物完成突变。
[0030] 2)对于非甲基化的质粒（例如从大肠杆菌JMllO或SCSllO菌株中提取的质粒）， 可通过转化dam+的大肠杆菌菌株（如DH5a、T0P10、JM109、XL1 - Blue等），再抽提获得 甲基化的质粒作为PCR反应模板。
[0031] 3)尽量采用高纯度的模板质粒，浓度调整为5(Γ100 ng/μ 1。
[0032] 三、引物设计原则 1) 在所突变的碱基前后需要各保留16~20个与模板互补的碱基； 2) 多个突变引物的设计必须以质粒的同一条链为模板，向同一个方向延伸； 3) 如果两个或两个以上的引物在同一个反应中的时候，它们突变位点之间的距离需在 60 bp以上。如果两个引物之间距离在60 bp之内，就需要进行两个反应进行PCR。在其中 一个引物的PCR完成以后，把PCR产物抽提以后作为模板加入另一个引物进行下一个PCR 反应。如果有5个以上的突变位点，应当进行两个PCR反应； 4) 引物的3'端应包含至少一个G或C碱基，尽量避免三个以上的重复碱基，以免错配； 5) 尽量将引物的GC含量控制在4(Γ60% ; 6) 请使用经过PAGE或HPLC纯化的引物，否则会降低突变阳性率。
[0033] 引物设计举例见图4。 四、定点突变反应 I) PCR反应体系：向PCR薄壁管中依次加入下列试剂： 实验组：
【权利要求】
1. 一种基于甲基化环状DNA分子的突变方法，其特征在于，包括以下步骤： a) PCR反应获得带有特定突变的环形单链DNA :以甲基化环状DNA为模板，使用带突变 位点的突变引物，采用高保真的耐热DNA聚合酶和高温DNA连接酶进行扩增； b) 将步骤a)的PCR产物使用限制性内切酶Dpn I消化，去除甲基化模板； c) 将步骤b)中的消化产物转入感受态细胞中，所述的带有特定突变的环状单链DNA修 复为带有特定突变的环状双链DNA，最终得到突变后的质粒。
2. 根据权利要求1所述的突变方法，其特征在于，步骤a)中，所述的高保真的耐热DNA 聚合酶为 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase。
3. 根据权利要求1所述的突变方法，其特征在于，步骤a)中，所述的高温DNA连接酶 为Taq DNA Ligase连接酶或9° N DNA连接酶。
4. 根据权利要求1所述的突变方法，其特征在于，所述的高保真的耐热DNA聚合酶与 高温DNA连接酶的添加比例为：酶活力单位比1 :60。
5. 根据权利要求1所述的突变方法，其特征在于，所述的突变引物是以甲基化环状 DNA为模板设计的单条引物，在突变位点前后各保留16~20个与模板配对的碱基。
6. 根据权利要求1所述的突变方法，其特征在于，步骤b)中，使用限制性内切酶Dpn I 消化的时间为5分钟至过夜。
7. 根据权利要求1所述的突变方法，其特征在于，步骤c)中，所述的消化产物是直接 转入感受态细胞中。
8. 根据权利要求1所述的突变方法，其特征在于，PCR反应的体系中还包含反应缓冲 液、GC反应缓冲液、dNTP、ATP、NAD+。
【文档编号】C12N15/10GK104404029SQ201410593852
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年10月30日 优先权日:2014年10月30日
【发明者】蒋国成, 陈旭, 陈刚, 佟勇 申请人:依科赛生物科技（太仓）有限公司