与甜瓜雄性不育ms5基因紧密连锁的分子标记BSA3?2及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种与甜瓜雄性不育ms5基因紧密连锁的分子标记BSA3?2及其应用，所述分子标记BSA3?2的引物序列为：BSA3?2F：TGCTTATGTGAGTGAGTCTGCTGAC，BSA3?2R：CAATGGTGTGGTGGAAGTTCTGGAA。上述分子标记BSA3?2可用于鉴定甜瓜雄性不育ms5 基因和甜瓜分子标记辅助育种。本发明根据高通量测序技术，得到甜瓜基因组数据，设计开发与甜瓜雄性不育相关的caps 分子标记，通过分子标记辅助选择育种的方法，在甜瓜幼苗期就可以进行甜瓜雄性不育植株的筛选，节省了育种的年限并提高了育种的效率，克服了现有技术中只能在开花期才能区分甜瓜雄性不育植株而带来的育种效率低下的问题。
【专利说明】
与甜瓜雄性不育ms5基因紧密连锁的分子标记BSA3-2及其应用
技术领域
[0001]本发明属于植物分子遗传育种研究领域，涉及一种与甜瓜雄性不育ms5基因连锁的分子标记及应用。【背景技术】[00〇2]甜瓜(CucuffiisL.)与其他作物相比较具有明显的杂种优势，多年来国内外的研究学者和育种工作者先后培育了大批量优良的甜瓜杂种一代种子，创造了巨大的经济效益。但是目前杂交制种仍然延续人工摘除母本雄花、人工授粉、套袋等措施，工序复杂、工作量大、成本高，容易造成花器官的损伤，从而造成产量的下降。McCreight和Elmstrom (1984)指出Fjf人工制种的成本为自然授粉成本的12-30倍。雄性不育对于降低人工制种的成本是一个重要并且稳定有效的方法，能够确保授粉的成功率及产量。植物雄性不育系在农业上有巨大的应用价值，因而雄性不育性的研究一直深受重视。雄性不育在植物界广泛存在，尤其是开花植物中，它是一种有性繁殖过程中不能产生正常的花药、花粉或雄配子的遗传现象。利用雄性不育培育不育系进行杂交制种，不仅能够降低制种成本，而且可以提高杂交种的纯度。随着分子生物学技术的发展，以不育系和相应的保持系为材料进行分子标记分析，可以获得优良亲本所具有的特异分子标记，从而在苗期实现筛选，减少田间的劳动量，降低生产成本。
[0003]甜瓜雄性不育的资源非常有限，共有5个雄性不育基因被发现(Bohn，1949,1964; Lozanov，1983;McCreight，1984,2005，Pitrat，1991，2002)。1991 年，Pitrat 指出甜瓜5个雄性不育基因分别位于甜瓜连锁图谱上不同的连锁群，基因之间未检测到互作，与甜瓜红茎基因连锁，与控制叶片黄化基因连锁，但是连锁程度并不紧密。其它4个雄性不育表现型(Bohn，1949，1964; Lozanov，1983 ;McCreight，1984，2005，Pitrat，1991，2002)随后被相继命名为和每一个雄性不育基因控制一种表现型，和基因在田间检测中很难通过表型鉴定;突变体是Cantaloup型甜瓜Za JoDa 4似仰的培育过程中发现的，该突变体材料具有抗白粉病等优良性状，该突变体植株的雄蕊比正常花株雄蕊小，而且花粉囊不开裂；显微观察结果显示突变体含有少量或者不含有花粉，人工授粉成功率低于其它植株12倍左右(Bohn and Principle，1964)。遗传规律的研究表明携带突变体姊妹交的内群体，雄性可育与雄性不育分离比率为3:1，并且与配置的杂交组合F2群体雄性可育与雄性不育的分离比率为9:7,结果显示与符合两对基因独立遗传规律(Bohn and Principle，1964)可通过表型鉴定，Park(2004)等利用突变体植株与“TAM Dulce”配置了 F2群体，研究基因的遗传规律，认为其受到一对隐性基因的控制，并找到与其连锁的SCAR标记，连锁距离为2.1cM。Park等利用F2群体鉴定ms-3遗传规律，认为单隐性核基因控制甜瓜雄性不育该结果与McCreight (1983,1984)的研究结果吻合，研究结果同样证实ms-Z和 male sterility -Zees/wrg■即为基因。由于和花器官发育初期雄花的退化，因此很容易通过田间性状进行鉴定(Leouv1ur et al.，1990;Pitrat，1991) offls-5突变体最早由美国Clause种子公司发现，并应用于杂交一代制种中，但是相关研究未见报到(Leouv1ur et al.，1990)。肥_5突变体最早于1966年在培育抗白粉病材料“PMR45”育种过程中发现，突变体植株的雄花在花蕾发育初期就明显少于可育植株，在雄花或者完全花植株中，花药数目减少空瘪，花粉在减数分裂时期就开始退化(Leouv1ur et al.，1990)。十多年来，关于甜瓜雄性不育的研究一直滞后于其他作物，而甜瓜因的研究更是未见相关报道。前人的研究结果显示，此均为独立遗传的雄性不育基因(Lecouv1ur et al.，1990 ;McCreight and Elmstrom，1984)，分别位于传统甜瓜遗传图谱第10、11、12条染色体上(Pitrat，1991; 2002)。甜瓜控制雄蕊发育基因(a)基因调控雌花中雄蕊的发育(Boualem et al.，2008)，Park的研究结果证实a基因与基因未检测到连锁关系，同样证明a基因与其它雄性不育基因也不存在连锁关系(Pirtrat 1991；
2002) ο
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种与甜瓜雄性不育基因ms5紧密连锁的分子标记BSA3-2及其应用。本发明选择ms5雄性不育突变体和雄性可育植株HM-1，配制ms5 XHM-1杂交群体，构建F2群体，提取252个F2单株的基因组DNA，多年多点，调查两个群体F2代群体的花粉育性分离比率，研究甜瓜雄性不育的遗传规律，对两个亲本进行高通量基因组重测序，设计CAPs标记，分析与甜瓜雄性不育基因连锁的区域，在该连锁区域内查找亲本间存在SNP突变的碱基区段，并分析SNP位点的酶切信息，获得存在CAPS突变的序列；针对突变序列设计引物，利用CAPs标记在甜瓜F2群体中进行雄性不育鉴定，分子标记的鉴定结果与表型鉴定结果一致。
[0005]本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
一种与甜瓜雄性不育基因ms5紧密连锁的分子标记BSA3-2，其引物序列为:
BSA3-2F:TGCTTATGTGAGTGAGTCTGCTGAC，
BSA3-2R:CAATGGTGTGGTGGAAGTTCTGGAA。
[0006]上述分子标记BSA3-2可用于鉴定甜瓜雄性不育ms5基因。
[0007]上述分子标记BSA3-2可用于甜瓜分子标记辅助育种，在苗期能够提早鉴定甜瓜雄性不育材料，不用等到植株开花后才能通过表型鉴定，为甜瓜育种、配置杂交组合、亲本的早期筛选节省了大量的时间及人力物力。。
[0008]本发明具有如下优点:
UCaps标记是以酶切位点产生单个碱基多态性的分子标记，由于该标记的特点是分布范围广，变异的稳定性强因此成为近年来进行基因定位的新一代标记。本发明根据高通量测序技术，得到甜瓜基因组数据，设计开发与甜瓜雄性不育相关的caps分子标记，通过分子标记辅助选择育种的方法，在甜瓜幼苗期就可以进行甜瓜雄性不育植株的筛选，节省了育种的年限并提高了育种的效率，克服了现有技术中只能在开花期才能区分甜瓜雄性不育植株而带来的育种效率低下的问题。
[0009]2、通过利用本发明提供的特异性引物对采用PCR方法检测待测甜瓜的基因组DNA，扩增CAPS分子标记BSA3-2，限制性内切酶XhoI酶切后，甜瓜雄性不育植株只有一条带，而雄性可育植株扩增条带经限制性内切酶Xho頂每切后，有两条条带，通过此分子标记可以准确对甜瓜进行雄性不育鉴定，用于筛选植株，大大提升了菠甜瓜的育种效率。
[0010]3、目前国内外对甜瓜雄性不育ms5基因连锁的分子标记未见相关报道，本发明的分子标记BSA3-2与甜瓜雄性不育基因紧密连锁，遗传距离为0.1CM。
[0011]4、本发明分子标记在甜瓜生产实践、育种中具有非常重要的价值。
[0012]5、操作方法简单，稳定性强，为甜瓜分子育种提供了辅助选择的新方法。【附图说明】
[0013]图1为BSA3-2标记检测甜瓜雄性不育的电泳图，图中:M为marker，由8条DNA片段组成，从下到上依次是100、250、500、7500、1000、2000、3000和500(^口;？1代表父本，雄性可育;P2代表母本，雄性不育，Fi为杂交一代，F2共有24个单株，1-8为雄性可育纯合植株，9-16 为雄性可育杂合植株；17-24为雄性不育植株;雄性不育植株在877bp为特异条带，酶切产物482bp产生特异条带为雄性可育植株条带，在两个位点都有条带的为杂合体，雄性可育。【具体实施方式】
[0014]下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
[0015]【具体实施方式】一:本实施方式提供了一种与甜瓜雄性不育ms5基因紧密连锁的分子标记BSA3-2，其引物序列为:BSA3-2F:TGCTTATGTGAGTGAGTCTGCTGAC，BSA3-2R:CAATGGTGTGGTGGAAGTTCTGGAA。[〇〇16] 上述分子标记BSA3-2的获得方法如下:1、甜瓜遗传群体的构建利用甜瓜雄性不育突变厚皮甜瓜ms5作母本，与黑龙江省薄皮甜瓜纯合品系HM-1配置杂交组合，得到F1、F2群体、B&Pi和B&P2群体。种植650株ms-5 X HM-1F2，获得不育植株，获得可育植株502个，不育植株148个，F2可育植株与不育植株分尚比率符合3:1。种植BCiPi群体 161株，BQPi群体中可育:不育为85:86,经卡方检测回交群体符合1:1分离比率。甜瓜雄性不育ms5受到一对隐性基因控制，基因型为mS5ms5,可育对不育显性。[〇〇17]2、基因组DNA的提取和基因池构建采用CTAB法提取252个F2单株的基因组DNA。
[0018]分别取F2-3家系中表现纯合的雄性不育及雄性可育各30个单株，构建用于分离群体分组分析(Bulk Segregating Analysis，BSA)的基因池，DNA浓度在lOOng/yL，构建可育基因池和不育基因池。[〇〇19]3、caps连锁标记筛选通过对雄性不育突变体ms5及HM1-1进行高通量测序，得到两个亲本的基因组序列信息，分析比较两个亲本间差异性位点，利用BSA方法获得与甜瓜雄性不育性状ms5紧密连锁的分子标记，共设计开发分子标记420对，在可育基因池和不育基因池之间进行PCR扩增和多态性筛选，共筛选到240对引物。筛选与甜瓜雄性不育性状连锁的分子标记，其中发现BSA3-2与甜瓜雄性不育性状紧密连锁。
[0020]【具体实施方式】二:本实施方式提供了一种利用分子标记法检测甜瓜雄性不育ms5基因的方法，具体步骤如下:
(I)提取待测样品的DNA，采用分子标记BSA3-2进行PCR扩增。1yL PCR反应体系为:30ng/yL DNA 2yL，BSA3_2引物上下游各0.2yL，10XPCR bufferlyL,2.5mM dNTp0.3yL,Taq酶0.1yL，ddH20 6.AyL13PCR扩增条件为:94°C预变性2min、94°C 变性20See、68°C 退火Imin、72°C延伸30Sec，共6个循环，每个循环温度降低2°C;94°C变性20See、58°C退火I min、72°(:延伸3056(:，共6个循环，每个循环温度降低1°(:;94°(:变性20366、50°(:退火3036(3、721€延伸30Sec，共20个循环，最后72°C延伸5min。
[0021](2)PCR反应产物用于XhoI酶切反应，酶切方法为:PCR反应产物10yL、XhoI限制性内切酶0.5yL，浓度为lU/yL、10XFast Digest buffer 2yL，去离子水7.5yL，酶切反应在37°C水浴锅中温浴20min，加入4yL 6 X loading buffer后于2%琼脂糖凝胶120U电压电泳30min，在Tanon2500凝胶成像仪进行拍照。
[0022](3)待测DNA样品经过PCR扩增和XhoI酶切后，电泳方式能检测出482bp片段的为雄性可育甜瓜材料，而片段大小为877bp的则是雄性不育的甜瓜材料(图1)。因此，通过紧密连锁标记的扩增能准确区分恢复基因位点的不同基因型，达到辅助育种的目的。
【主权项】
1.一种与甜瓜雄性不育基因ms5紧密连锁的分子标记BSA3-2，其特征在于所述分子标记BSA3-2的引物序列为: BSA3-2F:TGCTTATGTGAGTGAGTCTGCTGAC， BSA3-2R:CAATGGTGTGGTGGAAGTTCTGGAA。2.权利要求1所述分子标记BSA3-2在鉴定甜瓜雄性不育ms5基因中的应用。3.根据权利要求2所述的分子标记BSA3-2在鉴定甜瓜雄性不育ms5基因中的应用，其特征在于分子标记BSA3-2鉴定甜瓜雄性不育ms5基因的方法如下: (1)提取待测样品的DNA，采用分子标记BSA3-2进行PCR扩增； (2)PCR反应产物用于XhoI酶切反应，酶切方法为:PCR反应产物1yL、XhoI限制性内切酶0.5yL，浓度为lU/yL、10 XFast Digest buffer 241^，去离子水7.541^，酶切反应在37°(:水浴锅中温浴20min，加入4yL 6 X loading buffer后于2%琼脂糖凝胶120U电压电泳30min，在Tanon2500凝胶成像仪进行拍照； (3)待测DNA样品经过PCR扩增和XhoI酶切后，电泳方式能检测出482bp片段的为雄性可育甜瓜材料，而片段大小为877bp的则是雄性不育的甜瓜材料。4.根据权利要求3所述的分子标记BSA3-2在鉴定甜瓜雄性不育ms5基因中的应用，其特征在于所述PCR反应体系为:30ng/yL DNA 2yL，BSA3_2引物上下游各0.2yL，10 X PCRbufferlyL,2.5mM dNTp0.3yL，Taq酶0.lyL，ddH20 6.4yL05.根据权利要求3所述的分子标记BSA3-2在鉴定甜瓜雄性不育ms5基因中的应用，其特征在于所述PCR扩增条件为:94°C预变性2min、94°C变性20See、68°C退火I min、72°C延伸30Sec，共6个循环，每个循环温度降低2°C;94°C变性20See、58°C退火I min、72°C延伸30Sec，共6个循环，每个循环温度降低1°C;94°C变性20See、50°C退火30Sec、72°C延伸30Sec，共20个循环，最后72°C延伸5min。6.权利要求1所述分子标记BSA3-2在甜瓜分子标记辅助育种中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK106048025SQ201610445265
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月21日
【发明人】盛云燕, 于高波, 纪鹏, 郭晓红, 魏金鹏, 李德泽, 史闯
【申请人】黑龙江八农垦大学, 黑龙江八一农垦大学