一种野败型不育基因pcr检测引物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种野败型不育基因PCR检测引物WA7及一种组合引物WA7/RED4。该组合引物WA7/RED4包括WA7正向引物5’-TTTGCCTTATTTTGACCTGTTTGA-3’、WA7反向引物5’-TACTTTCAGGAGGGGAGGCA-3’、RED4正向引物5’-TTACAGGGGAGCAGAAACA-3’和RED4反向引物5’-TCTTCTCCTCTCTTTCAGCAC-3’。采用本发明组合引物WA7/RED4，一次PCR即可有效完成对杂交稻、杂草稻和常规稻的鉴定，简便，快速，准确，易于实现批量化检测。
【专利说明】—种野败型不育基因PCR检测引物及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种野败型不育基因PCR检测引物及一次性检测杂交稻、杂草稻和常规稻用的组合引物。
【背景技术】
[0002]亚洲栽培稻是我国重要的粮食作物之一。在种植面积上，常规稻即可以留种且后代不分离的水稻品种，占一半左右；三系杂交稻sativa )种植也占一半左右。其中在三系杂交稻中，野败型三系杂交稻是目前最主要种植类型。
[0003]近年来，在我国的水稻田中，又出现了另一种稻属植物一杂草稻sativa),其往往与栽培稻相伴生，分布极为广泛，几乎存在于世界上所有的稻作生产区。在世界上温带地区一些种植水稻国家危害已成为仅次于稗草和千金子的第三大杂草，密度达到2-40株/m2时可使水稻减产19%-89%，全季度干扰可使水稻减产61%，且蔓延速度不断加快，危害程度不断升级。
[0004]我们在对我国水稻主要种植区域进行杂草调查过程中，发现在许多地区，同一块田中会出现杂交稻、杂草稻、常规稻混杂在一起的情况。由于杂交稻、杂草稻和常规稻三者都属于禾本科稻属，拥有同一学名(Oryza sativa)，形态上也非常相似。因此，甚至科研人员在研究采样时候,也有时会分辨不清。由于杂交稻产量高、种植面积大、需要企业生产的种子量大，如果种子不纯，将会导致企业、农户等大量损失。现有对杂交稻是否含有不育基因进行检测，已有多条分子标记被开发(Narayanan et al., 1996; Sane et al., 1997;Yashitola et al., 2004; Rajendrakumar et al., 2007),然而这些引物只是当时开发出来用于对保持系和不育系进行了筛选。因此，当我们尝试用这些引物对杂交稻、杂草稻和常规稻进行筛选时候，根本不能使用。
[0005]如果开发出快速检测杂交稻、杂草稻和常规稻分子标记，将有利于人们快速有效分辨杂交稻、杂草稻和常规稻，提高稻种纯度以及科研样品准确度。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺陷，提供一种能够有效筛选杂交稻的分子标记。
[0007]为了达到上述目的，本发明提供了一种野败型不育基因PCR检测引物，该引物为WA7，包括正向引物5’ - TTTGCCTTATTTTGACCTGTTTGA-3’、反向引物5’ -TACTTTCAGGAGGGGAGGCA -3’。
[0008]本发明还提供了上述引物WA7在筛选杂交稻方面的应用。
[0009]为了能够一次性检测杂交稻、杂草稻和常规稻，本发明还提供了一种组合引物WA7/RED4,包括 WA7 正向引物 5’ - TTTGCCTTATTTTGACCTGTTTGA-3\ WA7 反向引物 5’ -TACTTTCAGGAGGGGAGGCA -3’、RED4 正向引物 5’ - TTACAGGGGAGCAGAAACA -3’ 和 RED4 反向引物 5’ - TCTTCTCCTCTCTTTCAGCAC -3，。
[0010]本发明还提供了上述组合引物在一次性检测杂交稻、杂草稻和常规稻方面的应用，具体检测方法如下:
(1)DNA提取:提取待检测的杂草稻、杂交稻或常规稻DNA ；
(2)PCR扩增:将步骤(1)提取的DNA进行PCR扩增；其中PCR扩增采用上述组合引物；
(3)电泳:将步骤(2)中的PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，染色观察。
[0011]步骤(2)中PCR 扩增体系为:DNA 1 μ L,2XPCR Mix 5.0 μ L，组合引物 WA7/RED4
0.25 μ L, ddH20 3.5 μ L ;DNA 浓度为 10 ng/μ 1 ； 2XPCR Mix 成分为:dNTP 0.2 mmolL \ KC1 100 mmol L \ Tris-HCl 20 mmol L \ Taq Polymerase 5 U/100 μ L、MgCl2 3.0mmol L 1 ;所述 Tris-HCl 的 pH 值为 8.5。
[0012]PCR扩增程序为94°C预变性5 min，94°C变性45 s，55°C退火45 s，72°C延伸1min, 30个循环；最后72°C延伸8 min。
[0013]本发明相比现有技术具有以下优点:通过对野败型不育基因和红色果皮基因，进行NCBI序列比对，设计和筛选一系列特异性检测三系杂交稻和杂草稻的引物，进而通过组合扩增片段大小的引物，优化两者混合比例及PCR程序，形成有效检测的分子组合标记WA7/ RED4，一次PCR即可有效完成对杂交稻、杂草稻和常规稻的鉴定。本发明对杂交稻、杂草稻及常规稻的检测简便，快速，准确，易于实现批量化检测，对于稻种混杂度检测等具有良好的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为各样品利用本发明组合引物进行分子标记的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
[0015]图中，Μ为100bp Marker ；1为江苏扬州(杂草稻)；2为江苏如皋(杂草稻)；3为江苏南京(杂草稻)；4为江苏盐城(杂草稻)；5为江苏连云港(杂草稻)；6为江苏宜兴(杂草稻)；7为江苏泗洪(杂草稻)；8为江苏徐州(杂草稻)；9为江苏沭阳(杂草稻)；10为江苏扬州(常规稻)；11为江苏如皋(常规稻)；12为江苏南京(常规稻)；13为江苏盐城(常规稻)；14为江苏连云港(常规稻)；15为江苏苏州(常规稻)；16为江苏宜兴(常规稻)；17为江苏泗洪(常规稻)；18为江苏徐州(常规稻)；19为江苏沭阳(常规稻)；20为三系杂交稻II优838 (杂交稻)；21为三系稻杂交汕优63 (杂交稻)；22为三系杂交稻抗优63 (杂交稻)；23为三系杂交稻神州3号(杂交稻)；24为三系杂交稻II优98 (杂交稻)；25为三系杂交稻II优838 (杂交稻)；26为三系杂交稻II优86 (杂交稻)；27为三系杂交稻宜优673 (杂交稻)。
【具体实施方式】
[0016]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
[0017]本发明进行杂交稻、杂草稻和常规稻检测用的组合引物WA7/RED4，包括WA7正向引物 5’ - TTTGCCTTATTTTGACCTGTTTGA-3\ WA7 反向引物 5’ - TACTTTCAGGAGGGGAGGCA-3’、RED4 正向引物 5’- TTACAGGGGAGCAGAAACA -3’ 和 RED4 反向引物 5’-TCTTCTCCTCTCTTTCAGCAC -3’。
[0018]利用上述引物进行杂交稻、杂草稻和常规稻一次性检测的方法如下:
1、DNA提取:提取各样品的DNA,提取方法如下: (1)颖果
取单粒种子去壳后于研钵中；
力口 300 μ L 预热(65? )抽提液(100 mmol Γ1 Tris-HCl pH 8.0，20 mmol L-1 EDTA,500 mmol Γ1 NaCl, 1.5% SDS)研磨后，再加入100 μ L预热(65。。)抽提液冲洗，转入1.5/mL离心管中，加预热(65°C ) 400 μ L抽提液溶液。65°C水浴30分钟，期间混匀3次；
加入100 μ 1 NaAc (1/4体积)，摇匀；
加入400 μ 1 (等体积)氯仿-异戊醇(内含4% (ν/ν)异戊醇，10% (ν/ν)乙醇)，摇匀；
离心(12000rpm、5min),要注意配平；转移上清液至另一 1.5ml管中，400 μ 1左右； 加入-20°C预冷的无水乙醇(2倍体积)至一定刻度，摇勻；
离心(12000rpm>5min);
弃无水乙醇，加入70%乙醇400ul左右，稍微混匀后放置lOmin左右，弃酒精、倒扣离心管于吸水纸上使DNA干燥；
加入200 μ 1 ΤΕ，加入lul RNA酶，用手轻弹使之溶解，室温放置10分钟，-20°C保存。
[0019](2)干标本和新鲜材料
在研钵中用液氮研磨成粉末1/3 1.5ml管；
加入 600 μ 165?提取液(100 mmol Γ1 Tris-HCl pH 8.0, 20 mmol L-1 EDTA, 500mmol Γ1 NaCl, 1.5% SDS)摇匀；
65°C温浴30min，间或振荡3_4次，温浴至样液变墨绿色；
加入100 μ 1 NaAc (1/4体积)，摇匀；
加入400 μ 1 (等体积)氯仿-异戊醇(内含4% (ν/ν)异戊醇，10% (ν/ν)乙醇)，摇匀；
离心(12000rpm、5min),要注意配平；转移上清液至另一 1.5ml管中，400 μ 1左右； 加入-20°C预冷的无水乙醇(2倍体积)至一定刻度，摇勻；离心(12000rpm、5min); 弃无水乙醇，70%乙醇洗两次，弃酒精、倒扣离心管于吸水纸上使DNA干燥；
加入200ulTE，加入1 μ 1 RNA酶，用手轻弹使之溶解，室温放置10分钟，-20°C保存。
[0020]2、PCR 扩增:
采用 10 μ L PCR 扩增体系[(DNA (10 ng/μ 1) 1 μ L,2XPCR Mix 5.0 μ L, Mix 特异性引物(F/R)(即组合引物 WA7/RED4) 0.25 μ L, ddH20 3.5 μ L),其中 2XPCR Mix 成分为 dNTP 0.2 mmol L \KC1 100 mmol L \Tris-HCl (pH 8.5) 20 mmol L \Taq Polymerase5 U/100 μ L,MgCl2 3.0 mmol Γ1 (南京基天生物技术有限责任公司购买)]。反应程序为94°C预变性5 min;94°C变性45 s，55°C退火45 s，2°C延伸1 min，30个循环；72°C延伸8min。
[0021]3、电泳:
PCR扩增后产物在6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，硝酸银染色照相。染色后如图1所示。从图1可以清楚区分杂草稻2-9、常规稻10-19、以及杂交稻20-27。
【权利要求】
1.一种野败型不育基因PCR检测引物，其特征在于:所述引物为WA7，包括正向引物5’-TTTGCCTTATTTTGACCTGTTTGA-3’、反向引物 5’ - TACTTTCAGGAGGGGAGGCA -3’。
2.权利要求1所述野败型不育基因PCR检测引物在筛选杂交稻方面的应用。
3.一种组合引物，其特征在于:所述组合引物为WA7/RED4，包括WA7正向引物5’ -TTTGCCTTATTTTGACCTGTTTGA-3MA7 反向引物 5’- TACTTTCAGGAGGGGAGGCA _3’、RED4 正向引物 5’ - TTACAGGGGAGCAGAAACA -3’ 和 RED4 反向引物 5’ - TCTTCTCCTCTCTTTCAGCAC -3’。
4.权利要求3所述组合引物在一次性检测杂交稻、杂草稻和常规稻方面的应用。
5.权利要求4所述的应用，其特征在于:所述组合引物一次性检测杂交稻、杂草稻和常规稻的步骤如下: (1)DNA提取:提取待检测的杂草稻、杂交稻或常规稻DNA ； (2)PCR扩增:将步骤(I)提取的DNA进行PCR扩增；所述PCR扩增采用所述组合引物； (3)电泳:将步骤(2)中的PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，染色观察。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于:所述步骤(2)中PCR扩增体系为:DNAI μ L，2 X PCR Mix 5.0 μ L，组合引物 WA7/RED4 0.25 μ L, ddH20 3.5 μ L ;所述 DNA 浓度为10 ng/μ I ;所述2XPCR Mix 成分为:dNTP 0.2 mmol L'KCl 100 mmol Tris-HCl 20mmol L \ Taq Polymerase 5 U/100 μ L、MgCl2 3.0 mmol L 1 ;所述 Tris-HCl 的 pH 值为8.5。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于:所述步骤(2)中PCR扩增程序为94°C预变性5 min，94°C变性45 s，55°C退火45 s，72°C延伸I min，30个循环；最后72°C延伸8mir1
【文档编号】C12N15/11GK104278089SQ201410492719
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2014年9月24日 优先权日:2014年9月24日
【发明者】戴伟民, 张帮华, 宋小玲, 强胜 申请人:南京农业大学