一种山核桃rca基因克隆的检测分析方法
【专利说明】
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物工程的技术领域，特别是一种山核桃RCA基因克隆的检测分析方法的技术领域。
【【背景技术】】
[0002]山核桃属胡桃科山核桃属植物，约有20个种，其中4个种原产中国，原产欧洲东南部及亚洲西部汉代传入中国，经数百年的繁育国内品种已经和国外的完全不同了。世界上基本亚热带地区都有胡桃科植物分布，品种数百种。国内各地都有分布，东北以秋子居多(野生)华北，西北也有分布。
[0003]山核桃在进行光合作用时，关键步骤固定C02过程需要Rubisco酶的催化。Rubisco酶的活性由植物体内复杂的机制进行调控，其中大量研究已证实Rubisco activase(RCA)能够活化并维持Rubisco酶的催化活性。同时RCA也被认为是植物在各种不同环境胁迫下对光合作用的关键调控因素，Mate等发现植物表达低水平的RCA会导致氮素积累和总生物量的减少，同时RCA表达很少或不表达的个体则无法在大气二氧化碳浓度下存活。因此，相关研究通过RCA调控提高C02吸收率最终提高作物产量具有重要意义。
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【发明内容】
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[0004]本发明的目的就是解决现有技术中的问题，提出一种山核桃RCA基因克隆的检测分析方法，本发明利用RACE和RT-PCR技术，克隆获得山核桃2个RCA基因全长，结合生物信息学分析，分析了在碱基序列、编码氨基酸序列及其他特性差异，并通过不同发育时期叶片的RCA基因表达情况探求RCA基因的表达模式，为利用基因工程手段调控RCA以增加光合速率和提尚抗逆性打下基础。
[0005]为实现上述目的，本发明一种山核桃RCA基因克隆的检测分析方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0006]a)序列检索与引物设计:通过克隆和比对确认山核桃存在2个RCA基因，利用β型RCA的ORF的序列作为查询标记在山核桃基因组中进行同源匹配，经同源基因序列比对和转录组序列分析，结合山核桃基因组片段检索，设计引物为Act in For: GCTGAACGGGAAATTGTCActin 内参引物、Act in Rev: AGAGATGGCTGGCTGGAAGAGG Actin 内参引物、Rca-abF:GACTTCGCCACTACGACCTG Rca基因部分片段扩取、Rca-adR: TTCTCCATACGACCATCACG Rca基因部分片段扩取、3，RACE-a: GAACCACCCAATACACTGTCAACAACCAA a亚基3端特异扩增、5，RACE-a:CCATCCATGTTGTTGTCCAGGTCGTAGTG a亚基 5端特异扩增、3’RA CE_b:GAACCACCCAATACACAGTCAACAACCAA b亚基 3端特异扩增、5’RACE-b:CCATCCATGTTGTTGTCCAAGTTGTACTG b亚基 5端特异扩增、qPCR-aF:GTGAAGAGGGTCCAACTTGCCGA a亚基定量、qPCR-aR:GCTCCCATCATCACTCCTCGCAG a亚基定量、qPCR-bF:GGCAAACAGACCGCCAAGGACA b亚基定量、qPCR-bR: TGGAAGAGCGAGTCAACCATACCC b亚基定量、Genome-aF:ACCTTCCATTAAAGTGCTGCGTGC a亚基基因组扩增、Genome-aR:CCAAGGGCAGCCTCGCTCAAGT a亚基基因组扩增、Genome-b IF: ACGAGGATGCTATTAAGAGCGGAAC b亚基基因组扩增、Genome-blR:GAAGTTGGATCAAAGTTCTCTGGCA b亚基基因组扩增；
[0007]b)RCA基因中间片段扩增:根据同源序列结合已有山核桃转录组，利用PrimerPremier 5.0软件设计中间片段引物，并以β-Actin作为内参基因，进行PCR扩增得到产物，经I %琼脂糖凝胶电泳可见550bp目的条带；
[0008]c)RCA基因3’端和5’端序列的扩增:根据中间片段测序结果分别设计c^PffiACE引物，以3 ’端反转录cDNA为模板，3，端特异性引物和UPM(Universal Primer Mix)进行一次扩增得到产物，经1.5%琼脂糖凝胶电泳可见850bp目的条带，同理，5’端特异性引物和UPM进行一次扩增得到产物，经1.5%琼脂糖凝胶电泳可见900bp目的条带，由于α和β亚基中间片段序列相似度很高，所以特异性扩增引物相近，而RACE扩增产物大小几乎相同说明α和β亚基3端序列和3端不翻译区及5端序列和5端不翻译区长度相近，所有测序结果经拼接和比对获得α和β亚基cDNA全长；
[0009]d)CcRCAa与CcRCAPcDNA序列特性的分析:CcRCAa与CcRCAP的cDNA全长相近，都包含完整的开放阅读框(ORF)和部分3端不翻译序列，预测编码472、435个氨基酸，理论相对分子质量51.52kD和47.52kD ,BLAST分析显示两者相似85.44%,两条蛋白序列N端前55和57个氨基酸预测为叶绿体转运肽(cTP)，那么CcRCAa与CcRCAP成熟蛋白应包含417和378个氨基酸，相对应的分子质量为46.1IkD和42.1lkD,CcRCAa推导的蛋白序列在C端比CcRCAfi多出37个氨基酸，其中包含两个半胱氨酸残基是RCA氧化还原调节的关键位点，两段保守的ATP结合区域GGKGQGKS和LFIND分别位于氨基酸序列的162到170位和222到227位，根据对菠菜和烟草RCA的研究，在山核桃RCA中169位的赖氨酸与Rubisco活化和ATP酶活密切相关，227位的天冬氨酸对亚基结合过程中γ -磷酸键的精细调节必不可少，此外，CcRCAa编码的氨基酸比CcRCAP在C端多37个，在已对比的序列中也有26个氨基酸种类差异，尽管未获得全部CcRCAa与CcRCAfi的不翻译序列，但已获得的序列存在明显区别，利用S i gna IP 4.1 Server程序对两蛋白质进行分析，没有发现信号肽，说明两蛋白质均非分泌蛋白；利用ChloroP1.1Server程序预测蛋白质序列的叶绿体转运肽(cTP)，结果表示，两基因蛋白质序列均含有叶绿体转运肽，且cTP前导序列长度分别为55和57，利用ExPASy的PSORT程序对蛋白亚细胞定位进行预测，结果表明RAC都定位在叶绿体中，通过TMpred程序预测蛋白质的跨膜结构域，结果显示，两蛋白具有2个跨膜螺旋，分别在氨基酸第88?107和143-162区域，说明CcRCA编码的蛋白可能是跨膜蛋白质，综合分析可知，CcRCA为细胞核基因编码，在叶绿体囊膜上发挥作用的酶蛋白；
[0010]e)RCA基因组序列分析:为了确认RCA和RCA是否来自同一条前体mRNA不同位置剪切，对山核桃基因组DNA进行分析，利用基因特异性弓I物扩取到CcRCAa、CcRCAP的基因组DNA序列，CcRCAa基因组DNA包括6个内含子和7个外显子，长度分别为1590bp和1419bp;CcRCA0包含5个内含子和6个外显子，长度分别为817bp和1308bp，利用DNAMAN软件进行多序列比对显示CcRCAa与CcRCAP相似性较高，达到73.23 %，与之前的mRNA的相似性比较结果一致，RCA基因组DNA的分析证实已发现的两种RCA mRNA分别由2个独立的基因编码而来，S卩I个a型基因和I个β型基因；
[0011]f)山核桃RCA的系统进化树分析:使用NCBI的blastx程序，对CcRCAa和CcRCAP基因进行蛋白同源性比对，发现山核桃与许多植物的RCA氨基酸序列都有较高的同源性，采用MEGA 5.05软件的邻接法(Neighbor-Joining，NJ)，构建山核桃CcRCAa和CcRCAP与美国山核桃等22种植物的RCA氨基酸序列的系统进化树，系统进化树显示，山核桃CcRCAa与美国山核桃(Caraya illinoensis)、美国红楓(Acer rubrum)苹果(Malus domestica)等的亲缘关系相近，CcRCAP与葡萄(Vitis vinifera)、大豆(Glycine max)和棉花(Gossypium hirsutum)最为接近，相同度分别为88%,89%和88%，其中对其保守结构域分析发现，其保守区具有2个ATP结合位点P-环序列和ATPase sensor2motif特殊位点，都属于ABC_ATPaseSuperfamilies超家族基因，但均与云杉(Picea sitchensis)、衣藻等的亲缘关系较远；
[0012]g)不同生长时期山核桃叶片中RCA表达分析:每隔一周于午后取同株不同枝头最外侧幼叶或叶片进行编号后，迅速液氮冷冻处理，置于_70°C冰箱保存，采用改良的CTAB法与试剂盒(TaRaKa MiniBEST UniversalRNA Extract1n Kit)联合使用提取不同生长时期叶片的总RNA,以提取所得总RNA为模板，OligodT为引物，按照Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)试剂盒(TaKaRa)操作说明书合成cDNA第一链，稀释5倍后用以RT-qPCR检测基因的相对表达量，自然条件下生长的山核桃叶在不同时期RCA的表达量，随着生长日期变化，CcRCAa和CcRCAP基因表达趋势相近。
[0013]作为优选，所述步骤d、步骤e、步骤f、步骤g中的CcRCAa指的是本实验采用3，/5，RACE和RT-PCR技术成功扩增出山核桃2个RCA基因的3 ’端，序列拼接分别获得全长cDNA序列;