一种山核桃rca基因克隆的方法
【专利说明】
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物工程的技术领域，特别是一种山核桃RCA基因克隆的方法的技术领域。
【【背景技术】】
[0002]山核桃属胡桃科山核桃属植物，约有20个种，其中4个种原产中国，原产欧洲东南部及亚洲西部汉代传入中国，经数百年的繁育国内品种已经和国外的完全不同了。世界上基本亚热带地区都有胡桃科植物分布，品种数百种。国内各地都有分布，东北以秋子居多(野生)华北，西北也有分布。
[0003]山核桃在进行光合作用时，关键步骤固定C02过程需要Rubisco酶的催化。Rubisco酶的活性由植物体内复杂的机制进行调控，其中大量研究已证实Rubiscoactivase (RCA)能够活化并维持Rubisco酶的催化活性。同时RCA也被认为是植物在各种不同环境胁迫下对光合作用的关键调控因素，Mate等发现植物表达低水平的RCA会导致氮素积累和总生物量的减少，同时RCA表达很少或不表达的个体则无法在大气二氧化碳浓度下存活。因此，相关研究通过RCA调控提高C02吸收率最终提高作物产量具有重要意义。
【
【发明内容】
】
[0004]本发明的目的就是解决现有技术中的问题，提出一种山核桃RCA基因克隆的方法，本发明利用RACE和RT-PCR技术，克隆获得山核桃2个RCA基因全长，结合生物信息学分析，分析了在碱基序列、编码氨基酸序列及其他特性差异，并通过不同发育时期叶片的RCA基因表达情况探求RCA基因的表达模式。为利用基因工程手段调控RCA以增加光合速率和提尚抗逆性打下基础。
[0005]为实现上述目的，本发明一种山核桃RCA基因克隆的方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0006]a)取材:每隔一周于午后取同株不同枝头最外侧幼叶或叶片，迅速液氮冷冻处理后，并置于-70°C冰箱中进行保存；
[0007]b)提取RCA:对步骤a)处理后的幼叶或叶片进行RCA提取；
[0008]c)序列检索:通过克隆和比对确认山核桃存在2个RCA基因，利用β型RCA的0RF的序列作为查询标记，在山核桃基因组中进行同源匹配；
[0009]d)引物设计:根据步骤c)获取的序列信息使用Primer Premier 5.0软件和primer 3.0 在线(http://b1inf0.ut.ee/primer3-0.4_0/)设计基因特异性引物用于cDNA、基因组DNA的PCR扩增和定量分析；
[0010]e)目的片段克隆及测试:根据已有同源基因保守序列和部分转录组序列，以叶片总RNA反转录的cDNA为模板，利用一对特异性引物扩取中间片段，预测产物大小550bp，以β -Actin作为内参基因，根据确认的RCA基因中间序列，通过3 ’ RACE特异性弓|物和5 ’ RACE特异性引物获取基因cDNA的5’端和3’端序列，将DNA片段插入进T载体，阳性克隆然后进tx测序；
[0011]f) RCA基因组序列分析:基因组DNA参照CTAB法从山核桃叶片中提取，经RNase消化后作为扩取RCA基因组DNA片段的模版，根据已有的cDNA和基因组DNA序列设计的引物扩取相应的DNA序列，测序后使用DNAMAN进行多序列比较分析；g)生物信息学分析:利用 ExPASy 的 ProtParam(http://web.expasy.0rg/protparam/)程序，计算蛋白质物理化学性质，包括相对分子量、氨基酸组成、总平均亲水性等；利用PsiPred程序(http://b1inf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)，进行蛋白质二级结构预测；利用 SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)程序，预测蛋白质的信号肽；使用 ChloroP 1.1Server (http: //www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/)程序，预测蛋白质序列的叶绿体转运肽(cTP);采用PS0RT(http://www.psort.0rg/)程序，进行蛋白质亚细胞定位预测；使用ClustalX2.1进行蛋白同源序列比对；采用MEGA 5.05软件，进行氨基酸的多序列比对和系统进化树分析；
[0012]h)总RNA提取和不同时期叶片的定量分析:采用改良的CTAB法与试剂盒(TaRaKaMiniBEST UniversalRNA Extract1n Kit)联合使用提取不同生长时期叶片的总RNA，以提取所得总 RNA 为模板，OligodT 为引物，按照 Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H_)试剂盒(TaKaRa)操作说明书合成cDNA第一链，稀释5倍后用以RT-qPCR检测基因的相对表达量。
[0013]作为优选，RCA指的是 Rubisco activase。
[0014]本发明的有益效果:本发明利用RACE和RT-PCR技术，克隆获得山核桃2个RCA基因全长，结合生物信息学分析，分析了在碱基序列、编码氨基酸序列及其他特性差异，并通过不同发育时期叶片的RCA基因表达情况探求RCA基因的表达模式，为利用基因工程手段调控RCA以增加光合速率和提高抗逆性打下基础。
【【具体实施方式】】
[0015]本发明一种山核桃RCA基因克隆的方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0016]a)取材:每隔一周于午后取同株不同枝头最外侧幼叶或叶片，迅速液氮冷冻处理后，并置于-70°C冰箱中进行保存；
[0017]b)提取RCA:对步骤a)处理后的幼叶或叶片进行RCA提取；
[0018]c)序列检索:通过克隆和比对确认山核桃存在2个RCA基因，利用β型RCA的0RF的序列作为查询标记，在山核桃基因组中进行同源匹配；
[0019]d)引物设计:根据步骤c)获取的序列信息使用Primer Premier 5.0软件和primer 3.0 在线(http://b1inf0.ut.ee/primer3-0.4_0/)设计基因特异性引物用于cDNA、基因组DNA的PCR扩增和定量分析；
[0020]e)目的片段克隆及测试:根据已有同源基因保守序列和部分转录组序列，以叶片总RNA反转录的cDNA为模板，利用一对特异性引物扩取中间片段，预测产物大小550bp，以β -Actin作为内参基因，根据确认的RCA基因中间序列，通过3 ’ RACE特异性弓|物和5 ’ RACE特异性引物获取基因cDNA的5’端和3’端序列，将DNA片段插入进T载体，阳性克隆然后进行测序；
[0021]f) RCA基因组序列分析:基因组DNA参照CTAB法从山核桃叶片中提取，经RNase消化后作为扩取RCA基因组DNA片段的模版，根据已有的cDNA和基因组DNA序列设计的引物扩取相应的DNA序列，测序后使用DNAMAN进行多序列比较分析；g)生物信息学分析:利用 ExPASy 的 ProtParam(http://web.expasy.0rg/protparam/)程序，计算蛋白质物理化学性质，包括相对分子量、氨基酸组成、总平均亲水性等；利用PsiPred程序(http://b1inf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)，进行蛋白质二级结构预测；利用 SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)程序，预测蛋白质的信号肽；使用 ChloroP 1.1Server (http: //www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/)程序，预测蛋白质序列的叶绿体转运肽(cTP);采用PSORT (http://www.psort.0rg/)程序，进行蛋白质亚细胞定位预测；使用ClustalX2.1进行蛋白同源序列比对；采用MEGA 5.05软件，进行氨基酸的多序列比对和系统进化树分析；
[0022]h)总RNA提取和不同时期叶片的定量分析:采用改良的CTAB法与试剂盒(TaRaKaMiniBEST UniversalRNA Extract1n Kit)联合使用提取不同生长时期叶片的总RNA，以提取所得总 RNA 为模板，OligodT 为引物，按照 Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H_)试剂盒(TaKaRa)操作说明书合成cDNA第一链，稀释5倍后用以RT-qPCR检测基因的相对表达量，RCA 指的是 Rubisco activase。
[0023]本发明利用RACE和RT-PCR技术，克隆获得山核桃2个RCA基因全长，结合生物信息学分析，分析了在碱基序列、编码氨基酸序列及其他特性差异，并通过不同发育时期叶片的RCA基因表达情况探求RCA基因的表达模式，为利用基因工程手段调控RCA以增加光合速率和提高抗逆性打下基础。
[0024]上述实施例是对本发明的说明，不是对本发明的限定，任何对本发明简单变换后的方案均属于本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种山核桃RCA基因克隆的方法，其特征在于，包括以下步骤: a)取材:每隔一周于午后取同株不同枝头最外侧幼叶或叶片，迅速液氮冷冻处理后，并置于-70°C冰箱中进行保存； b)提取RCA:对步骤a)处理后的幼叶或叶片进行RCA提取； c)序列检索:通过克隆和比对确认山核桃存在2个RCA基因，利用β型RCA的ORF的序列作为查询标记，在山核桃基因组中进行同源匹配； d)引物设计:根据步骤c)获取的序列信息使用PrimerPremier 5.0软件和primer3.0在线(http://b1inf0.ut.ee/primer3-0.4.0/)设计基因特异性引物用于cDNA、基因组DNA的PCR扩增和定量分析； e)目的片段克隆及测试:根据已有同源基因保守序列和部分转录组序列，以叶片总RNA反转录的cDNA为模板，利用一对特异性引物扩取中间片段，预测产物大小550bp，以β -Actin作为内参基因，根据确认的RCA基因中间序列，通过3 ’ RACE特异性弓I物和5 ’ RACE特异性引物获取基因cDNA的5’端和3’端序列，将DNA片段插入进T载体，阳性克隆然后进行测序； f)RCA基因组序列分析:基因组DNA参照CTAB法从山核桃叶片中提取，经RNase消化后作为扩取RCA基因组DNA片段的模版，根据已有的cDNA和基因组DNA序列设计的引物扩取相应的DNA序列，测序后使用DNAMAN进行多序列比较分析； g)生物信息学分析:利用ExPASy 的 ProtParam(http://web.expasy.0rg/protparam/)程序，计算蛋白质物理化学性质，包括相对分子量、氨基酸组成、总平均亲水性等；利用PsiPred 程序(http://b1inf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)，进行蛋白质二级结构预测；利用SignalP 4.1Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)程序，预测蛋白质的信号肽；使用 ChloroP 1.1Server (http: //www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/)程序，预测蛋白质序列的叶绿体转运肽(cTP);采用PSORT(http://www.psort.0rg/)程序，进行蛋白质亚细胞定位预测；使用ClustalX2.1进行蛋白同源序列比对；采用MEGA 5.05软件，进行氨基酸的多序列比对和系统进化树分析； h)总RNA提取和不同时期叶片的定量分析:采用改良的CTAB法与试剂盒(TaRaKaMiniBEST UniversalRNA Extract1n Kit)联合使用提取不同生长时期叶片的总RNA，以提取所得总 RNA 为模板，OligodT 为引物，按照 Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)试剂盒(TaKaRa)操作说明书合成cDNA第一链，稀释5倍后用以RT-qPCR检测基因的相对表达量。2.如权利要求1所述，一种山核桃RCA基因克隆的方法，其特征在于:RCA指的是Rubisco activase。
【专利摘要】本发明公开了一种山核桃RCA基因克隆的方法，其特征在于:包括以下步骤：a)取材、b)提取RCA、c)序列检索、d)引物设计、e)目的片段克隆及测试、f)RCA基因组序列分析、g)生物信息学分析、h)总RNA提取和不同时期叶片的定量分析，本发明利用RACE和RT-PCR技术，克隆获得山核桃2个RCA基因全长，结合生物信息学分析，分析了在碱基序列、编码氨基酸序列及其他特性差异，并通过不同发育时期叶片的RCA基因表达情况探求RCA基因的表达模式，为利用基因工程手段调控RCA以增加光合速率和提高抗逆性打下基础。
【IPC分类】C12N15/10, C12Q1/68
【公开号】CN105349527
【申请号】CN201510817331
【发明人】郑炳松, 金松恒, 纪国存, 裘玲玲
【申请人】浙江农林大学
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年11月23日