精子基因组dna的提取试剂及其方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别是指一种精子基因组DNA的提取试剂及其方法。
【背景技术】
[0002] 基因组DNA是动物遗传物质的载体，随着分子生物学和分子育种的发展，基因组 DNA的提取与保存成为动物科学实验和生产育种过程中越来越重要的内容。我们通常需要 大量高质量的动物基因组DNA来进行遗传鉴定和科学实验。通常情况下这些DNA是从动物 的血液、肌肉以及肝脏等组织中获取的。对于雄性动物而言，精液样本相对于其他组织更容 易获得，利用精液来提取动物DNA是更有效的方法。
[0003] 动物精液中含有高浓度的蛋白质，精子细胞膜较厚，一般的裂解方法难以使其破 裂，释放基因组，并且精子中含大量精胺和亚精胺，这是一类小分子阳离子，与DNA结合后 导致DNA溶解性下降。因此，提取高纯度的精子基因组DNA较为困难，而高浓度、密度的精 子，提取其DNA更为困难，如附睾精液。
[0004]目前提取基因组DNA的方法主要有传统的酚氯仿抽提法和试剂盒法，其中酚氯仿 抽提法操作繁琐且难以满足高质量实验的要求；试剂盒法的优点是简便、快捷，但缺点是目 前大多是针对血液、组织的专门提取试剂盒。这些方法对精子样本DNA抽提产率低、纯度 低，难以满足高要求的分子生物学和高通量基因组实验的要求。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于提出一种精子基因组DNA的提取试剂及其方法，对 精子样本DNA抽提产率高、纯度高。
[0006] 基于上述目的本发明提供的精子基因组DNA的提取试剂，包括：
[0007]预处理试剂I:pH为7. 4-8. 5,溶剂是蒸馏水，溶质是如下终浓度的物质：
[0008] 50-300mM可溶性盐，l-200mMEDTA;
[0009]预处理试剂II:pH为7. 4-8. 5,溶剂是蒸馏水，溶质是如下终浓度的物质：
[0010] 30-150mMTris.Cl，l-50mM的EDTA，300-700mM可溶性盐，0· 5-3%SDS，1-5% β-巯基乙醇；
[0011]蛋白酶K:80-120μg/ml;
[0012] RNA酶：8-12mg/ml。
[0013] 可选地，所述预处理试剂I中的可溶性盐是NaCl、KC1或NaAc。
[0014] 可选地，所述预处理试剂II中的可溶性盐是NaCl、KCl或NaAc。
[0015] 其中，预处理试剂I为DNA提供保护环境，在此环境下DNA可以呈稳定态，最少限 度地受到破坏。预处理试剂II中添加NaCl、KCl或NaAc，其单价金属离子能置换与DNA结合 的精胺和亚精胺，SDS消除残留的精胺和亚精胺，β-巯基乙醇破坏精子细胞膜表面的蛋白 质结构，释放其基因组DNA，达到对细胞的裂解消化作用。同时，预处理试剂II中Tris.C1、 EDTA、NaCl的混合液为DNA提供保护环境，在此环境下DNA可以呈稳定态，最少限度地受到 破坏。用上述试剂预处理样本，可以提高精子DNA抽提产率、纯度高，可以满足高要求的分 子生物学和高通量基因组实验的要求。
[0016] 基于相同的发明构思，本发明还提供了使用上述试剂提取精子基因组DNA的方 法，包括以下步骤：
[0017] 1)分离精子，用磷酸缓冲液洗涤，离心、去上清；
[0018] 2)预处理试剂I洗涤，离心、去上清；
[0019] 3)清洗后的精子中加入预处理试剂I、预处理试剂II、蛋白酶K、RNA酶，充分震 荡，消化；
[0020] 4)用基因组DNA抽提试剂盒法进行抽提；
[0021] 5)溶解并存储。
[0022] 优选地，步骤1)中所述精子总数1-20X106个，体积为10~20μ1。
[0023] 优选地，步骤1)中磷酸盐缓冲液用量为：每次500-1200μ1。
[0024] 优选地，步骤2)预处理试剂I的用量为：300~500μ1。
[0025] 优选地，步骤3)中消化时间为6-18h，温度为50-60°C。
[0026] 优选地，步骤3)中预处理试剂I为150-300μ1、预处理试剂II为150-300μ1、 30-50μ1 蛋白酶Κ、10-30μ1RNA酶。
[0027] 本发明提供的提取精子基因组DNA的方法清洗精子细胞，去除精液中的精浆，即 去除了精浆中大量水、果糖、蛋白质和多肽、其他糖类（如葡萄糖）、酶类（如前列腺素）、无 机盐和有机小分子等干扰精子DNA的抽提效果的物质，加入预处理试剂I洗涤，使精子中 DNA全程处于被保护的环境，防止其在加入蛋白酶后使释放出的DNA降解。因用磷酸盐缓冲 液清洗后再用预处理试剂I洗涤，更进一步去除影响最终纯度的杂质，使DNA在整个过程 中处于受保护的环境，从而提高了最终纯度。
[0028] 在预处理试剂II中加入β-巯基乙醇，更有效的破坏细胞膜蛋白质结构，释放基 因组DNA，提高抽提效率。另外，对两个预处理试剂中的pH进行了控制，使DNA处于更加稳 定的状态，降解率降低，从而提高了抽提效率。基于相同的发明构思，本发明还提供了精子 基因组DNA的提取试剂盒，该试剂盒包括上述预处理试剂I、预处理试剂II、蛋白酶K、RNA 酶。
[0029] 通过以上所述可以看出，本发明提供的精子基因组DNA的提取试剂及其方法，可 以有效提取动物精子样本DNA，抽提产率高、纯度高，满足高要求的分子生物学和高通量基 因组实验的要求，适用广泛、操作简便成本低、方便易得。
【附图说明】
[0030] 图1为本发明实施例精子基因组DNA的提取试剂及方法提取公猪精子样本DNA的 琼脂糖凝胶电泳图。
【具体实施方式】
[0031] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照 附图，对本发明进一步详细说明。
[0032] 实施例1 :提取公猪精子样本DNA及分析
[0033] 1、试剂
[0034] 预处理试剂I:pH=8. 0,溶剂是蒸馏水，溶质是如下终浓度的物质：
[0035] 150mMNaCl，10mMEDTA，该EDTA的pH=8.0。
[0036] 预处理试剂II:pH=8. 0,溶剂是蒸馏水，溶质是如下终浓度的物质：
[0037] 100mMTris.Cia_Tris.CU9pH= 8.0，10mMEDTA，500mMNaCl，l%SDS，2%e-· 基乙醇。
[0038]蛋白酶K:100μg/ml;
[0039] RNA酶：10mg/ml。
[0040] 2、实验样本的准备
[0041] 采集4只公猪的附睾精液进行平行实验，往公猪的附睾输精管中注入空气或磷酸 盐缓冲液，从附睾体和附睾尾的连接处分离出输精管，开口，将精子注入到离心管中保存。 或采集动物正常射出的精液。
[0042] 采取附睾精子为样本避免了对试验动物进行调教过程，大大减少了收集精子样本 的时间，减少人力和饲养成本，节约试验成本以及试验周期，分离附睾精子是利用还未调教 公猪精液最方便有效的方法。
[0043] 精子计数：总数10X106个，15μ1用于基因组DNA的提取。
[0044] 3、用步骤1中的试剂进行精子样本基因组DNA的提取
[0045] ①将分离得到的公猪的附睾精子加入到1. 5ml离心管中用磷酸盐缓冲液洗三次， 每次lml，1000rpm/min，离心 3min，弃上清；
[0046] ②用500μ1预处理试剂I洗一次，1000rpm/min，离心3min，弃上清；
[0047] ③对清洗后的精子中加入200μ1预处理试剂I，200μ1预处理试剂II，40μ1蛋 白酶Κ，20μ1RNA酶，充分震荡混匀后，56°C水浴，消化12h;
[0048] ④用基因组DNA抽提试剂盒法（Qiagen组织血液DNA抽提试剂盒）进行抽提；
[0049] ⑤用无RNA酶及DNA酶的水或DEPC水溶解DNA并存储。
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