苏氨酸脱氨酶、编码基因、载体、工程菌及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及苏氨酸酶基因、载体，和产苏氨酸脱氨酶基因工程菌及其构建方法和 应用，属于基因工程领域。 (二） 技术背景
[0002]苏氨酸脱氨酶（Threoninedeaminase，简称TD，EC4. 3. 1. 19)，又称苏氨酸脱水 酶，是生物体内氨基酸代谢的重要酶类，能够催化L-苏氨酸或L-丝氨酸脱氨生成α- 丁酮 酸或丙酮酸，尤其是在生物催化生产α-丁酮酸的工艺中具有关键的作用。α-丁酮酸是 一种是生产L-2-氨基丁酸、L-异亮氨酸、正丙醇、D-2-羟基丁酸以及食品配料的重要原材 料，尤其是L-2-氨基丁酸，作为抗癫痫药物左乙拉西坦和抗结核药物盐酸乙胺丁醇的重要 前体，受到广泛的关注。
[0003] 目前已经有一些苏氨酸脱氨酶的报道，例如来自于施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeriSDM的苏氨酸脱氨酶，其最高的底物浓度为30g/L。然而，这些苏氨酸脱氨酶对高 底物浓度的耐受能力较弱，大大限制了其在工业生产中的应用。因此筛选出新型的表达耐 高底物浓度的苏氨酸脱氨酶基因，并通过基因工程技术构建高表达的基因工程菌在α- 丁 酮酸的制备中具有重要的意义。 (三）
【发明内容】
[0004] 本发明目的是提供一种新的能够催化L-苏氨酸制备α- 丁酮酸的苏氨酸脱氨 酶，而且该酶具有更高的催化活力和底物耐受能力，更适用于工业化制备该中间体，解决了 一般的苏氨酸脱氨酶最适底物浓度低的问题；应用该菌种生产苏氨酸脱氨酶具有产量高、 工艺简单、便于工业化应用等优点，该菌株可以直接用于α- 丁酮酸的生产，而不需细胞破 碎。
[0005] 本发明采用的技术方案是：
[0006] 本发明提供一种来源于大肠杆菌（Escherichia coli)的苏氨酸脱水酶（记为 EcTD)，所述苏氨酸脱水酶的氨基酸序列为SEQ IDN0:1所示。
[0007] 1 MADSQPLSGAPEGAEYLRAVLRAPVYEAAQVTPLQKMEKLSSRLDNVILVKREDRQPVHS
[0008] 61 FKLRGAYAMMAGLTEEQKAHGVITASAGNHAQGVAFSSARLGVKALIVMPTATADIKVDA
[0009] 121 VRGFGGEVLLHGANFDEAKAKAIELSQQQGFTWVPPFDHPMVIAGQGTLALELLQQDAHL
[0010] 181 DRVFVPVGGGGLAAGVAVLIKQLMPQIKVIAVEAEDSACLKAALDAGHPVDLPRVGLFAE
[0011] 241 GVAVKRI⑶ETFRLCQEYLDDIITVDSDAICAAMKDLFEDVRAVAEPSGALALAGMKKYI
[0012] 301 ALHNIRGERLAHILSGANVNFHGLRYVSERCELGEQREALLAVTIPEEKGSFLKFCQLLG
[0013] 361 GRSVTEFNYRFADAKNACIFVGVRLSRGLEERKEILQMLNDGGYSVVDLSDDEMAKLHVR
[0014] 421 YMVGGRPSHPLQERLYSFEFPESPGALLRFLNTLGTYWNISLFHYRSHGTDYGRVLAAFE
[0015] 481 LGDHEPDFETRLNELGYDCHDETNNPAFRFFLAG*
[0016] 任何对SEQIDNO:1所示氨基酸序列中氨基酸进行缺失、插入或替换的处理获得 的多肽片段或其变体，只要其与SEQIDNO:1所示氨基酸序列具有95%以上同源性，均属 于本发明的保护范围。
[0017] 进一步，为实现EcTD在大肠杆菌等原核生物中的可溶性异源表达，通过基因工程 常规操作，以全合成的方法获得了对应于所述SEQIDN0 :1氨基酸序列的该苏氨酸脱氨酶 的核苷酸序列，如SEQIDN0:2所示。
[0018] 1 ATGGCGGACTCTCAGCCGCTGTCTGGCGCACCGGAAGGTGCTGAATACCTGCGTGCTGTA
[0019] 61 CTGCGTGCTCCGGTGTACGAAGCCGCCCAGGTGACGCCGCTGCAGAAGATGGAAAAACTG
[0020] 121 TCTTCCCGTCTGGATAATGTGATTCTGGTGAAACGTGAGGATCGTCAGCCGGTACACAGC
[0021] 181 TTCAAACTGCGTGGTGCCTACGCAATGATGGCTGGTCTGACCGAAGAACAGAAAGCACAC
[0022] 241 GGCGTTATTACGGCATCTGCTGGTAACCACGCACAGGGCGTAGCGTTCTCTTCCGCGCGT
[0023] 301 CTGGGCGTGAAAGCGCTGATCGTTATGCCAACCGCAACCGCCGACATCAAAGTAGATGCT
[0024] 361 GTGCGTGGCTTTGGCGGTGAAGTACTGCTGCATGGTGCAAACTTTGATGAGGCTAAAGCG
[0025] 421 AAGGCGATCGAACTGTCTCAGCAACAGGGCTTCACTTGGGTTCCTCCGTTCGATCACCCG
[0026] 481 ATGGTTATTGCCGGTCAGGGCACCCTGGCCCTGGAACTGCTGCAGCAAGATGCCCATCTG
[0027] 541 GACCGTGTCTTTGTACCGGTCGGCGGCGGTGGTCTGGCTGCAGGTGTAGCGGTTCTGATC
[0028] 601 AAACAGCTGATGCCGCAGATTAAAGTCATTGCGGTTGAAGCTGAAGATAGCGCGTGCCTG
[0029] 661 AAAGCAGCACTGGATGCGGGCCATCCGGTTGATCTGCCGCGTGTTGGTCTGTTTGCCGAA
[0030] 721 GGCGTTGCAGTTAAACGCATTGGTGATGAAACTTTTCGTCTGTGCCAGGAATACCTGGAC
[0031] 781 GACATCATCACTGTCGACTCCGATGCGATTTGTGCTGCTATGAAAGATCTGTTCGAAGAC
[0032] 841 GTGCGCGCTGTAGCTGAACCGTCTGGTGCTCTGGCTCTGGCAGGCATGAAGAAATATATC
[0033] 901 GCTCTGCATAACATCCGCGGTGAACGTCTGGCCCATATCCTGTCTGGCGCTAACGTGAAC
[0034] 961 TTCCACGGCCTGCGTTACGTGTCCGAACGTTGCGAACTGGGCGAACAGCGTGAAGCCCTG
[0035] 1021 CTGGCAGTTACTATCCCGGAGGAAAAGGGTTCCTTCCTGAAATTCTGCCAGCTGCTGGGT
[0036] 1081 GGCCGTAGCGTTACGGAATTCAATTACCGCTTCGCGGACGCTAAAAACGCGTGCATCTTC
[0037] 1141 GTGGGCGTACGTCTGTCTCGCGGTCTGGAGGAACGTAAGGAGATCCTGCAGATGCTGAAC
[0038] 1201 GATGGTGGCTATTCTGTAGTTGATCTGTCTGACGATGAAATGGCTAAACTGCACGTGCGT
[0039] 1261 TATATGGTCGGCGGTCGTCCATCCCATCCGCTGCAGGAACGTCTGTATTCCTTTGAATTC
[0040] 1321 CCTGAGTCTCCGGGTGCACTGCTGCGTTTCCTGAATACCCTGGGCACCTATTGGAACATC
[0041] 1381 TCTCTGTTCCACTACCGTAGCCACGGTACCGACTATGGTCGCGTACTGGCGGCATTCGAA
[0042] 1441 CTGGGTGATCACGAACCGGATTTCGAAACTCGCCTGAACGAACTGGGTTATGACTGTCAT
[0043] 1501 GATGAGACCAACAACCCGGCATTTCGCTTCTTCCTGGCGGGCTAA
[0044] 任何对SEQIDNO:2所示核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入 处理获得的核苷酸序列，只要其与该核苷酸序列具有90%以上的同源性，均属于本发明的 保护范围。
[0045] 本发明提供一种由所述重组苏氨酸脱氨酶编码基因构建的重组载体。
[0046] 本发明还提供一种由所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。
[0047] 本发明涉及所述苏氨酸脱水酶编码基因在制备苏氨酸脱水酶中的应用，所述的应 用为：构建含有所述苏氨酸脱氨酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，诱 导培养，从培养液中分离得到含有重组苏氨酸脱氨酶的菌体细胞。
[0048] 本发明将苏氨酸脱氨酶基因EcTD同表达载体pET_28b(+)连接，构建了含有 苏氨酸脱氨酶基因的表达重组质粒。将表达重组质粒pET-28b(+)-EcTD转化至大肠杆 菌BL21 (DE3)菌株中，获得含有重组质粒pET-28b(+)-EcTD的重组大肠杆菌BL21 (DE3) / pET-28b(+)-EcTD。以重组菌为酶源，进行生物催化。具体地，将重组基因工程菌E.coli BL21 (DE3) /pET28b(+) -EcTD接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，在37°C培养 10h，再以1. 5%接种量（v/v)接种至新鲜的含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中， 37°C培养至菌体浓度0D600约0. 8左右，再向LB液体培养基中加入终浓度为0.ImM的IPTG， 28°C诱导培养10h后，将培养液在4°C、lOOOOrpm离心lOmin，弃去上清液，收集湿菌体，即为 含有胞内表达重组苏氨酸脱氨酶的大肠杆菌BL21 (DE3)/pET28b-EcTD湿菌体。
[0049] 本发明还涉及所述的苏氨酸脱氨酶在生物催化L-苏氨酸制备α-丁酮酸中的 应用，具体地，所述的应用为：以含苏氨酸脱水酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体 为催化剂，以L-苏氨酸为底物，以pH值4. 0-10.0的缓冲液为反应介质，在15~50 °C、 150-200rpm条件下进行催化反应，反应完全后，将反应液分离纯化得到α- 丁酮酸。
[0050] 反应式如下：
[0051]
[0052] 进一步，所述缓冲液优选pH 7. 0的磷酸钠缓冲液。
[0053] 进一步，所述反应体系中底物初始浓度为100~600g/L，优选120~480g/L，最优 选 240g/L。
[0054] 进一步，所述反应体系中生物催化剂的质量用量以湿菌体的重量计为5~50g/L， 优选5~30g/L，最优选10g/L，所述湿菌体含水质量为70~90 %。
[0055] 进一步，所述反应液分离纯化的方法为：反应结束后，将反应液离心去除大肠杆菌 细胞，上清液减压蒸馏至1/2体积，除去反应液中残留的氨，80°C保温40min，使蛋白质变 性，离心去除变性蛋白；为了更好地去除培养基和细胞内含物残留的色素，加热时可以在反 应中加入少量的活性炭脱色，再用循环水式真空栗进行抽滤，收集澄清的滤液；然后进行旋 转蒸发除去水，得到α-丁酮酸。
[0056] 本发明的有益效果主要体现在：本发明提