一种n-酰基高丝氨酸内酯酶及其编码基因和重组菌的制作方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种N-酰基高丝氨酸内酯酶及其编码基因和重组菌。
【背景技术】
[0002]与高等多细胞生物一样，很多单细胞的原核细菌个体之间也可以通过分泌一些信号分子来相互交流信息，感应周围环境中种群的密度，协调彼此之间的行为，在不同群体密度情况下，表现出不同的行为，从而更好的适应周围环境的变化，增加生存的能力，这种现象被命名为群体感应(Quorum sensing,QS) ο
[0003]很多植物病原菌的致病性群体感应系统的机制调控，而以细菌群体感应系统为靶标的群体淬灭(Quorum Quenching，QQ)已被证明是防治这一类细菌性病害的有效策略。群体淬灭研究中，降解AHL信号分子(N-酰基高丝氨酸内酯)的酶已被证实能有效的干扰细菌的群体感应系统，并且能通过基因工程生防菌或转基因植物的方法减轻病害(Dong，Y.H.，Wang ,L.H.,Xu,J.L.,Zhang,H.B., Zhang,X.F., and Zhang ,L.H.(2001).Quenchingquorum—sensing-dependent bacterial infect1n by an N~acyI homoserinelactonase.Nature 411,813-817.)0
[0004]2000年，Dong等筛选到一株能特异性降解AHL类信号分子的芽孢杆菌，并从中分离到一个大小为750bp的基因，命名为aiiA基因，编码250个氨基酸的酶，该酶与其他已知的酶没有显著的同源性，是一种全新的酶。将aiiA基因转入致病菌胡萝卜软腐欧文氏菌(ErwiniacarotovcmOSCGl后，显著减少了后者AHL类信号分子的产生，降低了其对马铃薯、胡萝卜等的致病性。将该基因转入烟草、马铃薯后，这些植物对胡萝卜软腐欧文氏菌SCGl导致的软腐病抗性大大增强(Dong Y.H.,et al.,AiiA,an enzyme that inactivates the acyIhomoserine lactone quorum-sensing signal and attenuates the virulence ofErwinia carotovora.Proc Natl Acad Sci USA,2000.97(7): 3526-3531)。继续研究表明，该酶是通过打开AHL分子的内酯环而使其生物活性大大降低，因此被命名为N-酰基高丝氨酸内酯酶，即AHL内酯酶(AHL-1actonase) ^HL内酯酶的发现与潜在的巨大应用价值引起了人们的巨大关注，很多地方的研究者投入到寻找新的AHL内酯酶的研究工作中。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是，提供一种N-酰基高丝氨酸内酯酶及其编码基因和重组菌。旨在提供一种新型的N-酰基高丝氨酸内酯酶，为N-酰基高丝氨酸内酯酶的研究和应用奠定基础。
[0006]本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下:
[0007]一种N-酰基高丝氨酸内酯酶，所述N-酰基高丝氨酸内酯酶的氨基酸序列如SEQ IDN0.2所示ο
[0008]本发明提供的N-酰基高丝氨酸内酯酶，其氨基酸序列的编码序列克隆自保藏于中国海洋微生物菌种保藏管理中心的盐渍盐单胞菌MCCClA01339(Halomonas salaria)。
[0009]本发明还提供了所述N-酰基高丝氨酸内酯酶的编码基因。
[0010]优选地，所述N-酰基高丝氨酸内酯酶的编码基因，其核苷酸序列如SEQID N0.1所不O
[0011]本发明是通过构建一株盐渍盐单胞菌的基因组文库，通过以功能驱动的蓝白斑筛选得到AHL降解酶，通过分析确认该酶为N-酰基高丝氨酸内酯酶，然后设计特异性引物从盐渍盐单胞菌中克隆得到N-酰基高丝氨酸内酯酶的编码基因。所采用的实验方法包括基因组文库构建技术;聚合酶链式反应(PCR)技术、DNA的提取、酶切、连接、蓝白斑筛选等常规的分子生物学技术，构建一株盐渍盐单胞菌的Fosmid基因组文库，通过以功能驱动的蓝白斑筛选AHL降解酶并得到Fosmid阳性克隆，序列测定得到AHL降解酶的一段开放阅读框(ORF)，然后通过序列比对、生物信息学分析及高效液相色谱检测等方法确定该酶为N-酰基高丝氨酸内酯酶。之后以盐渍盐单胞菌总DNA为模板，扩增出一段N-酰基高丝氨酸内酯酶编码基因的DNA序列，把这一段DNA序列连接到表达载体如pET-28a等表达质粒上，然后导入大肠杆菌进行尚效表达，获得该基因表达的目的蛋白进彳丁研究，进一步确定基因的功能和酶学性质。这一段DNA序列与前人所发现的N-酰基高丝氨酸内酯酶在基因来源、DNA和氨基酸大小、酶的分子大小、酶的活性等方面都不同。
[0012]本发明还提供了含有所述N-酰基高丝氨酸内酯酶编码基因的重组载体。
[0013]优选地，所述的重组载体是将所述N-酰基高丝氨酸内酯酶编码基因插入到大肠杆菌表达载体中得到的表达N-酰基高丝氨酸内酯酶的重组表达载体。所述的大肠杆菌表达载体优选为pET-28a载体。
[0014]本发明还提供了含有所述N-酰基高丝氨酸内酯酶编码基因的转基因细胞系或重组菌。
[0015]优选地，所述重组菌是将所述N-酰基高丝氨酸内酯酶编码基因通过所述重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选得到表达N-酰基高丝氨酸内酯酶的转基因重组菌。所述的大肠杆菌优选为大肠杆菌BL21(DE3)。
[0016]本发明还提供所述的重组菌在生产N-酰基高丝氨酸内酯酶中的应用。
[0017]本发明还提供所述的N-酰基高丝氨酸内酯酶在降解N-酰基高丝氨酸内酯中的应用。降解N-酰基高丝氨酸内酯时，所述N-酰基高丝氨酸内酯酶适合的反应温度为30?50°C，反应pH值为7.0以上。
[0018]本发明还提供一种生产N-酰基高丝氨酸内酯酶的方法，该方法为:将权利要求6所述的重组菌进行发酵培养，将培养后的重组菌体破壁后进行分离纯化，得到N-酰基高丝氨酸内酯酶。
[0019]本发明从盐渍盐单胞菌中得到的N-酰基高丝氨酸内酯酶具有以下特征:
[0020]1.该N-酰基高丝氨酸内酯酶的编码基因长度为786bp，编码261个氨基酸，分子量约为29kDa;
[0021 ] 2.该N-酰基高丝氨酸内酯酶最适温度为40°C，适合反应温度范围为30?50°C (若无特殊说明，该N-酰基高丝氨酸内酯酶酶活测定以OOHL分子为基准底物，下同)；
[0022]3.该N-酰基高丝氨酸内酯酶的适合反应pH为7.0以上；
[0023]4.二价金属离子的浓度在ImM时，锌离子对于酶活有60%的提高，钴离子和EDTA对于酶活没有影响，铜离子、钙离子、亚铁离子、镁离子和锰离子对酶活有抑制作用。
[0024]5.该N-酰基高丝氨酸内酯酶对不同碳链长度及修饰的N-酰基高丝氨酸内酯(AHL分子)均有良好的降解作用，但对不同底物的活性不同。
[0025]与现有技术相比，本发明的有益效果为:
[0026]I，本发明提供的N-酰基高丝氨酸内酯酶可以水解多种AHL类分子，对不同碳链长度及修饰的N-酰基高丝氨酸内酯(AHL分子)均有良好的降解作用，为系统进行新型N-酰基高丝氨酸内酯酶关于生物防治的后续研究及开发利用奠定了基础。
[0027]2，本发明所述的N-酰基高丝氨酸内酯酶在天然的盐渍盐单胞菌中含量很低，较难检测到酶的活性，无法直接利用天然的盐渍盐单胞菌得到的N-酰基高丝氨酸内酯酶进行应用研究，应用基因工程菌来表达本发明所述的N-酰基高丝氨酸内酯酶，可以使酶的活力提高数倍。
【附图说明】
[0028]图1是通过设计特异引物克隆获得的N-酰基高丝氨酸内酯酶基因序列的电泳结果图。
[0029]图2是重组菌BL21(DE3)诱导表达后的N-酰基高丝氨酸内酯酶的SDS-PAGE蛋白电泳图。
[0030]图3是纯化的N-酰基高丝氨酸内酯酶的SDS-PAGE蛋白电泳图。
[0031 ]图4是pH对N-酰基高丝氨酸内酯酶活力的影响曲线图。
[0032]图5是温度对N-酰基高丝氨酸内酯酶活力的影响曲线图。
[0033]图6是不同种类的金属离子对N-酰基高丝氨酸内酯酶活力的影响示意图。
[0034]图7是N-酰基高丝氨酸内酯酶对不同碳链长度及修饰的N-酰基高丝氨酸内酯(AHL分子)底物的酶活力示意图。
【具体实施方式】
[0035]下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。
[0036]实施例1:盐渍盐单胞菌的培养
[0037]将盐渍盐单胞菌(Halomonas salaria，菌株编号:MCCC 1A01339，中国海洋微生物菌种保藏管理中心)接种于液体培养基中，所述液体培养基的组分配比为:蛋白胨(peptone) 10g/L，酵母提取物(yeast extract)5g/L，氯化钠(NaCl)30g/L，pH值为7.0。然后在30°C，200rpm恒温摇床振荡培养48h，于10，OOOrpm离心2min收集菌体用于总DNA的提取。
[0038]实施例2:盐渍盐单胞菌基因组文库构建及AHL信号分子降解酶阳性克隆的筛选
[0039]米用文库构建试剂盒(CopyControl?Fosmid Library Product1n Kit，购自epicentre公司)构建出一株盐渍盐单胞菌的Fosmid基因组文库，通过以功能驱动的蓝白斑筛选AHL降解酶并得到Fosmid阳性克隆，序列测定得到AH