O-磷酸丝氨酸巯解酶突变体以及利用其生产半胱氨酸的方法
【专利说明】〇-磷酸丝氨酸巯解酶突变体以及利用其生产半胱氨酸的 方法
[0001] 本申请要求2010年10月20日提交的韩国专利申请10-2010-0102665的优先权； 本申请是国际申请日为2011年10月14日的中国专利申请No. 201180002041.9的分案申 请。
技术领域
[0002] 本发明涉及一种具有源自耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis)的对应于 SEQ ID NO: 1氨基酸序列的0-磷酸丝氨酸巯解酶（又称"0PSS"）突变体，其缺失三至七个 C-末端氨基酸残基。本发明还涉及编码该0PSS突变体的核酸分子、含有该核酸分子的表 达载体以及利用该表达载体转化得到的转化体。此外，本发明涉及一种在0PSS突变体存在 下，通过0-磷酰-L-丝氨酸（0PS)与硫化物发生反应生产半胱氨酸的方法。
【背景技术】
[0003] 半胱氨酸是一种在所有生物体中的硫代谢过程中起重要作用的氨基酸。它用于蛋 白，如发角蛋白、谷胱甘肽、生物素、蛋氨酸和其它含硫代谢产物的生物合成，以及作为辅酶 A的前体。此外，已知半胱氨酸的生物合成与其它氨基酸，包括L-丝氨酸、L-甘氨酸和L-蛋 氨酸的生物合成密切相关。工业上，L-半胱氨酸及其衍生物被应用于多种领域包括制药业 (用于治疗支气管疾病）、化妆品行业（洗发水、烫发用组合物等），以及食品行业（抗氧化 剂、调味剂、面团助剂（dough aids)等）。
[0004] 传统上，L-半胱氨酸在工业上是通过酸水解人类头发或动物羽毛而获得（Ko Aida 编，氨基酸生产的生物技术（Biotechnology of the Amino Acids Production)，p 217-223,1986)。然而，不仅由头发或羽毛生产的半胱氨酸确实产量低至7-8%，而且使用盐 酸或硫酸产生了大量的环境污染物。此外，消费者可能对从头发或羽毛提取具有强烈的反 感。这些问题对于开发环保的L-半胱氨酸生产方法形成推动，导致了利用微生物发酵生产 L-半胱氨酸。
[0005] 微生物生产L-半胱氨酸中的代表是利用微生物进行生物转化D, L-ATC (Ryu 0H，Ju JY,和 Shin CS,生物化学方法（Process Biochem.), 32:201-209, 1997)。然而，由 于D，L-ATC前体的低溶解度，该转换方法难以适用于工业。另一种L-半胱氨酸的生产方 法是用大肠杆菌直接发酵（专利号EP 0885962B;Wada M *TakagiH，Appl.Microbiol. Biochem.，73:48-54, 2006)。微生物中L-半胱氨酸的过度积累产生胞内毒性，导致高浓度 L-半胱氨酸的生产受限。为了克服这一缺陷，使用了 L-半胱氨酸转运蛋白，然而产量没有 出现显著改善。
[0006] 关于L-半胱氨酸在细菌和植物中的生物合成途径，0-乙酰丝氨酸（0AS) 作为中间体前体提供L-半胱氨酸的碳骨架（Kredich NM和Tomkins GM，J. Biol. Chem.，241:4955-4965, 1966)。酶0-乙酰丝氨酸巯解酶（0ASS)，用硫化氢作为硫供体，催化 0-乙酰丝氨酸向硫胱氨酸的转化，最后生成半胱氨酸，释放乙酸。或者，S0 4可被还原成硫 代硫酸盐用作半胱氨酸生产中的硫供体（Nakamura T，Kon Y，Iwahashi H,和Eguchi Y，J. Bacteriol.，156:656-662, 1983)。经由OAS的半胱氨酸生物合成途径使用两种酶，催化丝 氨酸向0AS转化的丝氨酸乙酰转移酶（CysE)，催化0AS向半胱氨酸转化的半胱氨酸合酶 (CysK)。值得注意的是，其中丝氨酸乙酰转移酶（CysE)对终产物半胱氨酸的反馈抑制高度 敏感（Wada M和 Takagi H，Appl. Microbiol. Biochem.，73:48-54, 2006)。因此，需要对反馈 抑制不敏感的改变的酶，但是其很难开发。
【发明内容】
[0007] 技术问题
[0008] 为了克服现有技术中遇到的问题，本发明人对高产L-半胱氨酸进行了深入和彻 底的研宄，结果发现在超嗜热古菌（Aeropyrumpernix)、结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis)和阴道毛滴虫（Trichomonasvaginalis)中存在着米用〇-磷酰-L-丝 氨酸（0PS)特异性途径而非0AS-特异性途径来合成L-半胱氨酸的0-磷酸丝氨 酸巯解酶（〇PSS)(MinoK和IshikawaK，FEBSletters，55l:l33_l38,2〇〇3;Burns KE,BaumgartS,DorresteinPC,ZhaiH,McLaffertyFff,和BegleyTP,J.Am.Chem. Soc.，127:11602-11603,2005;Westrop⑶，GoodallG，MottramJC，和CoombsGH，J.Biol. Chem.，281:25062-25075, 2006)，结核分枝杆菌的0PSS与额外的酶mec+和cysO-起催化 OPS向半胱氨酸的转化，当其被去除五个C-末端氨基酸残基时，即使额外的酶不存在时也 可利用Na2S作为硫供体使0PS转化成半脫氨酸（AgrenD,SchnellR和SchneiderG,FEBS letters, 583:330-336, 2009)，从而实现本发明。
[0009] 技术方案
[0010] 因此，本发明的目的是提供一种具有源自耻垢分枝杆菌的对应于SEQ ID N0 :1的 氨基酸序列的0-磷酸丝氨酸巯解酶（又称"0PSS"）突变，其缺失三至七个C-末端氨基酸 残基。
[0011] 本发明另一个目的是提供编码该0PSS突变体的核酸分子。
[0012] 本发明又一个目的是提供含有该核酸分子的表达载体。
[0013] 本发明还一个目的是提供用该表达载体转化得到的转化体。
[0014] 本发明又一个目的是提供一种在0PSS突变体存在下，用硫化物使0-磷酰-L-丝 氨酸转化成半胱氨酸的方法。
[0015] 有益效果
[0016] 如上所述，酶活性提高的0PSS突变体对于由0-磷酸丝氨酸向L-半胱氨酸的酶转 化是必不可少的，其可用于以简单的方式大规模由0PS高产L-半胱氨酸。
【附图说明】
[0017] 图1所示为根据温度的0PSS活性。
[0018] 图2所示为0PSS对pH的敏感性的组图。
[0019] 图3所示为通过SDS PAGE分析的pET系统和pCL-Pcjl系统中酶的表达水平的照 片。
[0020] 图4所示为将纯化的0PS发酵培养液转化成半胱氨酸的0PSS的酶活性。
[0021] 图5所示为将OPS发酵培养液转化成半胱氨酸的0PSS的酶活性。
[0022] 图6所示为1L发酵罐中以0PS作为底物，通过0PSS转化的0PS和半胱氨酸的生 产。
[0023] 图7为含有编码0PSS突变体的基因的pCL-Pcjl表达载体的示意图。
[0024] 最佳实施方式
[0025] 按照其中一个方面，本发明提供一种源自耻垢分枝杆菌的具有SEQ ID N0 :1的氨 基酸序列的0PSS突变体，其较野生型0-磷酸丝氨酸巯解酶氨基酸序列缺少3~7个C-末 端氨基酸残基。
[0026] 在本发明的一个实施方案中，本发明的0PSS突变体可具有SEQ ID N0S:2、3和4中 的一个氨基酸序列。具有SEQ ID N0 :2氨基酸序列的0PSS突变体可被进一步修饰成77位 脯氨酸残基（Pro)被丝氨酸残基（Ser)取代。此外，具有SEQ ID N0:2氨基酸序列的0PSS 突变体可被进一步修饰成131位苏氨酸残基（Thr)被丙氨酸残基（Ala)取代，137位赖氨酸 残基（Lys)被天冬酰胺残基（Asp)取代，以及238位苏氨酸残基（Thr)被丝氨酸残基（Ser) 取代。此外，与上述突变体的氨基酸序列同源性至少为50 %，优选60 %、70 %、75 %和80 %， 更优选85%、90%和95%，最优选97%至99%的氨基酸序列落入本发明的范围内。
[0027] 术语"耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatics) "是指放线菌门中的杆状菌株， 其为扁平的、直的或稍弯的，有不规则的分支，可被碱性染料苯胺染色。在本发明中，发现当 其氨基酸序列被修饰时，来自该菌株的〇-磷酸丝氨酸巯解酶能够催化L-半胱氨酸以提高 的产量生物合成。
[0028] 如本文所使用，术语"0-磷酸丝氨酸巯解酶（0PSS) "是指催化0PS转换成半胱氨酸 的酶。该酶首次发现于超嗜热古菌（Aeropyrum pernix)中并被命名（Mino K和Ishikawa K，FEBS letters, 551:133-138, 2003, SEQ ID NO:6)。
[0029] 可使用各种众所周知的方法获得0PSS。这些方法的示例包括但不限于，基于密码 子优化的基因合成技术，通过该技术能获得高产的目的酶，以及根据微生物遗传信息的大 量储存，利用生物信息学方法筛选有用的酶资源。在本发明的一个实施方案中，利用0PS作 为底物合成半胱氨酸的0PSS酶是从各种微生物中筛选到的。为此，使用合适的培养基及本 领域已知的培养条件获得细胞沉淀（经裂解），然后通过对含酶上清液的纯化来提供0PSS 酶。
[0030] 如本文所使用，术语"突变体"是指显示出遗传或非遗传表型的稳定改变的培养物 或个体。当与0PSS(0-磷酸丝氨酸巯解酶）结合使用时，术语"突变体"是指发生遗传改变， 从而与野生型相比，活性得到有效提高