和阳离子脂质 体钙法。
[0053] 如本文所使用，术语"用重组载体转化的宿主细胞"是指在宿主细胞中含有携带目 的基因的重组载体的宿主细胞。适用于本发明的宿主细胞可能是原核或真核细胞。实例包 括肠杆菌和棒形细菌，优选大肠埃希氏菌属、沙雷菌属，最优选大肠杆菌（E. coli)。
[0054] 根据其另一个方面，本发明提供一种生产半胱氨酸的方法，包括在本发明的0PSS 突变体存在下，用硫化物转化0PS。
[0055] 本发明的突变适用于大规模生产半胱氨酸。当使用表达所述突变体的转化体时， 大规模生产半胱氨酸可在本领域众所周知的最佳培养条件下完成。因此，大规模生产半胱 氨酸方法包括在本领域众所周知的最佳培养条件下培养所述转化体。
[0056] 为用作为底物，0PS可以是纯化形式，或含0PS的发酵培养物形式。纯0PS可市售 获得，如Sigma-Aldrich公司的产品编号No. P0878或Wako公司的CAS407-41-0所指明的 产品。然而，经微生物发酵获得的含0PS的培养物，比市售的纯0PS更具经济优势，因为含 0PS的培养物可无需额外的纯化直接使用，且转化所必需的辅因子PLP可以在发酵培养液 中获得。
[0057]只要可转换成巯基（SH)，任何硫化合物均可用于本发明。优选的，可使用Na2S、H2S 或S 203的液体或气体形式。
[0058] 在本发明的一个实施方案中，是用Na2S作为硫源。Na 2S可以酶转化中使用的0PS 的0. 1至3倍的摩尔浓度添加。具体地，Msm-T-HA2,其半胱氨酸转化率为80%，与Msm-T相 当，在以下反应条件下，其使用浓度为50 y g/mL，包括：50mM 0PS发酵培养液或60mM纯0PS 发酵培养液，lOOmM 或 120mM Na2S，以及 0. 2mM PLP。
[0059] 对本领域熟练的技术人员是显而易见和易于理解的是，酶转化过程可以进行 优化并用高活性酶放大反应规模，在一个实施方案中，在50mg Msm-T-HA2存在下，培养 19. 317g/L 0PS发酵培养液，产生的半胱氨酸浓度高达9.075g/L。在1L发酵罐中，在所述 突变体存在下，0PS转化成半胱氨酸的转化率为71. 83% (图6)。
[0060] 缩写和术语
[0061] 为了更好地解释本发明，并指导本领域的技术人员来实现本发明，需要对下面的 词语和方法进行说明。除非本文另有明确要求，说明书和权利要求书通篇中，术语"包括 (comprise)，""包括（comprising)，"等应解释为包含性的意义，与排除或用尽的意义相对， 也就是说，指"包括但不限于"的含义。单数术语"a，" "an，"和"the"包括复数引用，除非 本文另有清楚地说明。例如，术语"包括细胞"是指"包括一个细胞或多个这种细胞，但不限 于此。"
[0062] 当用来说明两个或两个以上的项目时，单词"或"涵盖了该词的所有以下解释：列 表中的任何项目，列表中的所有项目，列表中所有项目的任意组合。
[0063] 除非另有说明，本文中使用的所有技术和科学术语与本领域熟练的技术人员所知 具有相同的含义。以下公开了相关方法和材料，但在本发明的实际操作或实验中，可使用类 似或等同的方法和材料。下面给出的材料、方法和实例是为了说明而非限制本发明。本发 明的其它特征和优势将通过下面的描述和所附权利要求书变得显而易见。
[0064]缺失：其中一个或多个核苷酸或氨基酸残基被分别从核酸分子或蛋白中去除的突 变。
【具体实施方式】
[0065] 可通过下面的实施例更好地理解本发明，这些实施例用来解释说明，但不应视为 对本发明的限制。
[0066]实施例1 :0PSS的开发
[0067] 据报道超嗜热古菌、结核分枝杆菌和阴道毛滴虫具有利用0PS的酶0PSS，而 非在大肠杆菌中那样以0AS作为半胱氨酸合成的底物（Mino K和Ishikawa K，FEBS letters, 551:133-138, 2003 ;Burns KE, Baumgart S,Dorrestein PC,Zhai H, McLafferty FW,和 Begley TP, J. Am. Chem.Soc., 127:11602-11603, 2005 ;Westrop GD，Goodall G, Mottram JC,和 Coombs GH, J. Biol. Chem.，281:25062-25075, 2006)。基于该报道，本发 明人发现两种类型的使OPS转化成半胱氨酸的0PSS，它们来自超嗜热古菌和结核分枝杆菌 H37Rv。其中，来自结核分枝杆菌H37Rv的0PSS酶用于筛选同源氨基酸。结果是，分别从耻 垢分枝杆菌str.MC2155、红球菌（Rhodococcus jostii)RHAl和皮痕诺卡氏菌（Nocardia farcinica) IFM10152 中获得三种 0PSS 突变体 Msm-〇PSS、Rjo 0PSS 和 Nfa-〇PSS。
[0068] 为了从各菌株中获得0PSS，构建了通常用于酶表达的pET28a载体系统 (Novagen)。用于克隆五种不同的0PS巯解酶的各模板和引物及由此产生的重组质粒列于 下表1中。如表1所示的合适的模板和引物组合，用于PCR反应以扩增各0PSS基因。用 Ndel和Hindlll消化PCR产物和pET28a载体（37°C 3小时）。将各基因片段连接到消化的 pET28a载体（Novagen)上。基于测序，确定带有各0PSS的基因的表达载体的构建。将酶表 达载体引入大肠杆菌OE3)中，生产能够表达五种0PSS酶的菌株。酶的名称列于下表1。
[0069]表1
【主权项】
1?源自耻垢分枝杆菌（Mycobacteriumsmegmatis)的O-磷酸丝氨酸疏解酶（OPSS)突 变体，其具有与SEQIDNO:1相同的氨基酸序列，其中所述源自耻垢分枝杆菌的0-磷酸丝 氨酸巯解酶（OPSS)突变体缺少野生型OPSS氨基酸序列的三至七个C-末端氨基酸残基。
2. 根据权利要求1所述的源自耻垢分枝杆菌的OPSS突变体，其缺少五个C-末端氨基 酸残基。
3. 根据权利要求2所述的源自耻垢分枝杆菌的OPSS突变体，其具有SEQIDNO:2的 氨基酸序列。
4. 根据权利要求1所述的源自耻垢分枝杆菌的OPSS突变体，其中77位脯氨酸残基 (Pro)被丝氨酸残基（Ser)取代。
5. 根据权利要求4所述的源自耻垢分枝杆菌的OPSS突变体，其具有SEQIDNO:3的 氨基酸序列。
6. 根据权利要求1所述的源自耻垢分枝杆菌的OPSS突变体，其中131位苏氨酸残基 (Thr)、137位赖氨酸残基（Lys)和238位苏氨酸残基（Thr)分别被丙氨酸残基（Ala)、天冬 酰胺残基（Asp)和丝氨酸残基（Ser)取代。
7. 根据权利要求6所述的源自耻垢分枝杆菌的OPSS突变体，其具有SEQIDNO:4的 氨基酸序列。
8. 根据权利要求1所述的源自耻垢分枝杆菌的OPSS突变体，其在以下条件下显示出最 佳活性，包括： i) 加入约〇? 001~约2mMPLP(5'_磷酸吡哆醛）或约0? 001~约IOOmMDIT(二硫苏 糖醇）作为辅因子； ii) 反应温度25~60°C;以及 iii)pH6. 0 ~10. 0。
9. 编码权利要求1-8任一项所述OPSS突变体的核酸分子。
10. 含有编码权利要求1-8任一项所述OPSS突变体的核酸分子的表达载体。
11. 用权利要求10所述表达载体转化得到的转化体。
12. -种生产半胱氨酸的方法，其包括在权利要求1-8任一项所述OPSS突变体存在下， 使0-磷酰-L-丝氨酸（OPS)与硫化物发生反应。
13. 根据权利要求12所述生产半胱氨酸的方法，其中OPS为纯化形式或含OPS的发酵 培养物的形式。
14. 根据权利要求12所述生产半胱氨酸的方法，包括选自Na2S、NaSH、（NH4) 2SH、H2S和 S2O3的硫化物，其全部为气态或液态。
15. 根据权利要求12所述生产半胱氨酸的方法，其中硫化物的用量是OPS摩尔浓度的 0? 1~3倍。
16. 权利要求1-8任一项所述OPSS突变体在由OPS生物合成半胱氨酸中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种具有源自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的对应于SEQ ID NO：1氨基酸序列的O-磷酸丝氨酸巯解酶(OPSS)突变体，其缺失三至七个C-末端氨基酸残基。此外，本发明还公开了编码OPSS突变体的核酸分子、含有该核酸分子的表达载体，以及用该表达载体转化得到的转化体。此外，本发明提供一种生产半胱氨酸的方法，其中在OPSS突变体存在下，使O-磷酰-L-丝氨酸(OPS)与硫化物发生反应。OPSS突变体具有改善的酶活性，可通过简单的酶转化反应进行L-半胱氨酸的环保生产。
【IPC分类】C12P13-12, C12N9-10, C12R1-34, C12N15-54
【公开号】CN104762273
【申请号】CN201510105512
【发明人】申秀安, 张真淑, 严惠媛, 赵宰贤, 宋秉哲, 李京珉
【申请人】Cj第一制糖株式会社
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2011年10月14日
【公告号】CN102741400A, CN102741400B, EP2444486A1, EP2444486B1, EP2796549A1, US9127324, US20120190080, WO2012053777A2, WO2012053777A3