专利名称：：一种辅酶a的制备工艺的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种辅酶A的酶促合成反应工艺。(二)
背景技术：
1954年，Hoagland提出了动物组织内辅酶A生物合成的途径为ATP_C02ATP泛酸+半胱氨酸——泛酰半胱氨酸-一~泛酰巯基乙胺——4，-磷酸泛酰巯基乙胺ATPATP------^去磷酸辅酶A-----^辅酶ALevintow也提出了相同的生物合成途径。1959年，Brown确定辅酶A生物合成的主要途径为ATPL-半胱氨酸，ATP泛酸-------M，-磷酸泛酰---------------------4'-磷酸泛酰-L-半胱氨酸-----^泛酸激酶磷酸泛酸半胱氨酸合成酶脱羧酶ATPATP4，-磷酸泛酰巯基乙胺-----------------------^去磷酸辅酶A---------------^辅酶A磷酸辅酶A焦磷酸化酶去磷酸辅酶A激酶第一步是辅酶A生物合成中最重要的一步。最初辅酶A主要从酵母细胞内提取分离得到，以后也经化学全合成制备，但两方法都不理想，产率低或制造工艺复杂。而微生物发酵法生产辅酶A的开发利用，有望提供大量价廉的辅酶A以满足需要。辅酶A发酵始于1950年。Deveries等将弗氏链霉菌(Str印tomycesfradiae)于32。C培养88h，发酵单位很低，仅仅5u/ml。尔后的研究，特别是Ogata和Shimizu等发现几乎所有微生物细胞内都有辅酶A合成酶系，而以两株产氨短杆菌(BrevibacteriumammoniagenesIFO12071和IFO12072)的活性最强，发酵单位可达413u/ml。Shimizu等用产氨短杆菌详细研究了辅酶A的发酵工艺。文献报导的辅酶A制备工艺路线1、以酵母为原料的提法(破壁、提取)(吸附)(洗脱)新压榨酵母沸水提取液766型活性炭吸附物氨乙醇，洗脱液先84'C，后冷却pH6_>(吸附)(洗脱)(浓缩)粗制品浓縮KOH，717甲酸型树脂;吸附物甲酸，甲酸铵)诜fl&液55-60"C(pH值中性即可)pH6(脱盐)(洗脱)(沉淀、干燥)766型活性炭吸附物氨乙醇)洗脱液(浓縮),HNO,,丙酮，中间品55-60'CpH2-3(溶解、去杂质)(还原)(共盐沉淀)(去锏离了)HO，，732、704树脂，滤液CvsHC1，锌汞齐还原液Cu,O;沉淀物通入H，S)pH2-335-40°CpH2.5(去半胱氨酸)(浓縮)(沉淀)滤液732树脂)滤液^i5"^浓縮液il^辅酶A成品pH3我国在采用新压榨酵母发酵合成辅酶A也取得了一定成绩，但在提取纯化工艺上，没有根本改变，资料介绍活力损失2030%，按新鲜压榨酵母计算，收率仅为3000单位/kg。另外，此纯化工艺中采用锌汞齐还原，此法不仅操作复杂，劳动强度大，收率低，而且影响生产工人的身体健康和造成环境污染。2、以猪肝为原料的GMA提取法(绞碎、提取)(除蛋白)(吸附)水5%CCl3COOH"IGMA勿脂新鲜猪肝"^rrn^r提取液~~rr^~~"滤液-^gma—coa煮沸.15分钟4小时0.01mol/LHCl—O.lmol/LNaCI，0.01mol/LHCI—lmol/LNaCl.、，丄-=-HZoA洗脱液(酸化)(吸附)(脱盐、洗脱)HCln,仏A^LD—601HNOj,氨乙醇一CoA浓集液-^LD—601—CoA-^氨醇洗脱液pH23(浓缩、酸化)(沉淀)(脱水、干燥)HN03^上HN03,丙酮丙阑-上清液~~u。c，'沉淀物-~~^~k:0a丙酮粉pH2.5pH2.53'P2Os此工艺收率低、纯度差，资料介绍每kg肝中仅得辅酶A丙酮粉2X104单位，效价为120单位/mg，纯度50%，且成品色泽较黄。GMA-LD-601组合工艺总收率为30%。3、产氨棒杆菌生物合成法^原来用酵母、白地霉等菌体细胞，经破壁提取辅酶A，因含量少，使产量受到一定的限制。1974年研究成功加入泛酸作前体，应用产氨短杆菌发酵合成辅酶A，并于1976年正式投入生产，成本比提取工艺下降4倍，质量由50单位/毫克提高到100单位/毫克以上。(斜面培养)(种子培养)(发酵)(酶合成)，衬粗打稱活化培养基i,茌仆拍汰种子培养基n,瓧7並发酵培养基m,廿酧彼反应液w,入战诚产氨紐蹄pH7",虮,M—活化菌体PH7,肌'M'种子液pH7，抓,24h发酵液PH6,饥,4h合成液(吸附、洗脱)(浓缩、沉淀、溶解)(阳离子交换)(阴离子交换)竭性炭'氣酵液,洗脱液=1,粗品溶液~|^阳离子交换液~^鹏子魏液pH2.5-3pH1.5-2pH2.5(还原)(络合)(除铜)(离子交换)':胱氣酸，H2SQ,锌汞齐V她Cu20Vl化八仏通入H2S仏w^732树脂，7Q4树脂她《*(浓缩、干燥).岫坊AAa-^~>还原液~^~*络合物u,'^'除铜液-"精制液-^辅酶A成品40CpH4~5，2h
发明内容本发明的目的在于克服现有技术存在的一些缺陷，提供一种辅酶A制备方法。通过微生物的三磷酸腺苷二钠再生体系进行酶促合成辅酶A的制备工艺可分成两大部分即发酵和提取纯化。发酵部分包括微生物菌种选育、发酵条件和酶促反应条件。这一部分的关键涉及到使用菌种的选择和酶促反应的条件。能进行酶促合成辅酶A的菌种有很多，如酵母菌、白地霉菌、短杆芽孢杆菌、假单孢菌、产氨棒杆菌等。从国内外的文献报道来看，其中产氨棒杆菌通过发酵进行酶促合成辅酶A的产量是最高的，我们的工艺中采用的也是产氨棒杆菌。酶促反应的条件是指在微生物发酵到一定程度时加入辅酶A合成所需要的原料，即前体物质包括盐酸半胱氨酸、泛酸钙、三磷酸腺苷二钠等。提取纯化部分包括吸附、浓縮、分子筛层析、还原、沉淀。这部分工艺中的关键是分离纯化柱的选用和还原反应，文献上采用的是活性碳吸附柱吸附及阳柱、阴柱分离。为了实现本发明的目的，本发明依据了下述的技术方案。一种辅酶A酶促合成反应工艺包括发酵部分和提取纯化部分；(1)发酵部分所选用的辅酶A生产菌种经发酵培养，检测PH值、OD值、残糖并且镜检应无杂菌；向酶反应液中分批次投入前体物质盐酸半胱氨酸，泛酸钙、三磷酸腺苷二钠。酶反应温度控制在29。C3rC之间进行，总体反应时间控制1822小时，空气流量控制为l:0.5，搅拌，得到反应液；反应液酸化、压滤，得到压滤清液。(2)提取纯化部分步骤(1)所得的压滤清液选用M210-B型非极性大孔树脂进行吸附分离，洗脱得到分离液，分离液中加入用L-半胱氨酸为络合剂、投入亚铜离子反应形成巯醇盐，分别用稀酸和纯化水洗涤、脱铜后得浓缩液；采用G-25型葡聚糖凝胶树脂对脱铜后的浓縮液进行分离纯化，利用核酸蛋白检测仪280nm波长检测，收集辅酶A和有效成分；浓縮液再用饱和的强碱，如氢氧化钾、氢氧化钠或氢氧化锂溶液调节PH值至4.55.0，优选氢氧化锂溶液调节PH值。以巯基乙醇为还原剂，温度控制在3436°C,时间控制在1014小时；浓縮液又用硝酸-丙酮混合液来沉淀辅酶A控制，pH为2.5，混合液温度应控制57t:，过滤，得辅酶A湿品、然后干燥。本发明与现有技术相比提高了辅酶A的纯度，每lmg含辅酶A的效价均不低于300单位，比国家标准高出50单位；本品稳定性考察结果将贮存条件定为遮光，密封，在-2(TC冷冻保存；并将有效期期限确定为18个月，比国家标准超出6个月。具体实施方式辅酶A的制备工艺的发酵和提取纯化两大部分中，本发明仅对发酵部分的酶促合成反应阶段，取纯化部分的分离、浓縮阶段、还原阶段进行了改进，其它部分仍延用原制备工艺的公知技术，因此，要实施例中未对公知的制备工艺进行详细的说明。实施例11、菌种培养。将培养好的AS1.925产氨棒杆菌菌种移入发酵罐培养，培养温度控制在283(TC，空气流量l:1，培养20小时，培养终点控制pH应为6.26.3，0D为2.02.2;得发酵罐菌种。2、酶促合成反应。零小时投入公知前体物质前，先加入破壁剂苯扎溴铵，然后分别在2小时、3小时、4小时、5小时补加前体物质。前体物质总投料量重量百分比为0.1%的盐酸L-半胱氨酸、0.07%的泛酸钙、0.2%的三磷酸腺苷二钠，将前体物质平分成五份，分次加入；反应温度控制在2931°C，总体反应时间控制约为20小时，空气流量控制为1:0.5，搅拌，控制终点测效价为300350u/ml，得反应液。3、预处理。反应液用浓硫酸酸化，调节pH在1.51.8，板框压滤得到压滤清液，滤饼烘干做饲料。4、分离、浓缩。用DA210-B型非极性大孔树脂吸附滤清液，流速控制在1/3装柱体积/小时，得饱和树脂；用0.03%的稀硝酸洗涤，流速控制在1/3装柱体积/小时，得洗涤后树脂；用氨乙醇为脱附剂脱附，流速控制在l/3装柱体积/小时，收集流出液pH在2.07.0部分，得分离液。浓縮液效价控制在25003000u/ml,体积约分离液I体积的1/10，得浓縮液。5、成盐、脱铜、浓縮、分离。用L-半胱氨酸为络合剂，向步骤4所得的浓缩液中投入氧化亚铜，硫酸络合，水解后成盐，成盐后分别用稀酸和纯化水洗涤辅酶A铜盐。铜盐沉淀用1.7倍络合液体积的纯化水制成浆状，调节pH至3.2—3.3，H2S脱铜6-8小时。浓縮液效价控制在25000-35000u/ml，浓縮后体积约为原体积的1/10，得浓缩液。浓縮液选用G25型葡聚糖凝胶树脂纯化分离，流速为V20装柱体积，分离流出液的收集，根据控制指示核酸蛋白检测仪及自动记录仪显示收集有效成分。再次浓縮，控制浓縮液效价单位在5800062000u/ml，体积控制在原体积1/8左右。6、还原、浓縮。步骤5最后得到的浓縮液，用饱和的氢氧化锂溶液调节pH至4.55.0，以巯基乙醇为还原剂，按每100单位加15ml巯基乙醇的比例加入，温度控制在3436°C，时间控制在12小时；浓缩液效价单位控制在5800062000u/ml。7、沉淀、干燥。沉淀辅酶A用硝酸-丙酮混合液，其pH控制为2.5，混合液温度应控制57°C，过滤，得湿品；以变色硅胶为干燥剂，干燥箱温度控制在25"土rC，真空干燥，时间控制为48小时，得干品。实施例2:酶促合成反应阶段分步加入前体物质对辅酶A效价单位的影响。依据实施例1辅酶A制备方法，在酶促合成反应阶段分别按1次全部加入所需前体量，分2次、3次、4次、5次、6次加入所需前体量，制备得辅酶A样品l、2、3、4、5、6，按辅酶A法定标准检测每lml含辅酶A的效价单位，具体检测结果如下样品样品l样品2样品3样品4样品5样品6每lml含辅酶A的效价282295310312317280根据试验数据可知辅酶A酶促合成反应阶段分步加入前体，可以提高辅酶A的效价单位，明显优于1次性加入前体。实施例3:分离阶段选用不同型号大孔树脂对辅酶A收率及纯度的影响样品1:依据实施例1的辅酶A制备方法，在提取纯化工艺分离阶段使用DA201-A型大孔树脂吸附分离。样品2:依据实施例1的辅酶A制备方法，在提取纯化工艺分离阶段使用DA201-B型大孔树脂吸附分离。样品3:依据实施例1的辅酶A制备方法，在提取纯化工艺分离阶段使用CAD型大孔树脂吸附分离。按按辅酶A法定标准检测发酵原液及洗脱液每lml中含辅酶A的效价单位，同时计算其吸附率、洗脱率及其分离前后纯度，试验结果如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>试验结果表明选用DA201-B型大孔树脂进行吸附分离其吸附率、洗脱率、洗脱液纯度均较高。实施例4:还原工艺使用不同的强碱对辅酶A效价单位的影响。样品1:依据实施例1的辅酶A制备方法，在还原工艺使用氢氧化钾调节PH值。样品2:依据实施例1的辅酶A制备方法，在还原工艺使用氢氧化锂调节PH值。样品3:依据实施例1的辅酶A制备方法，在还原工艺使用氢氧化钠调节PH值。按辅酶A法定标准检测每lml含辅酶A的效价单位，样品1、样品2、样3具体检测结果如下样品样品1样品2样品3每lml含辅酶A的效价308317301根据试验数据可知辅酶A还原工艺使用氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化钠等强碱溶液调节PH值，其中氢氧化锂能明显提高辅酶A的效价单位。实施例5:本发明还原工艺与文献报道3所述还原工艺比较。样品1:依据实施例1的辅酶A制备方法制得样品1，还原工艺用饱和的氢氧化锂溶液调节pH至4.55.0，以巯基乙醇为还原剂，按每100单位加15ml巯基乙醇的比例加入，温度控制在3436'C，时间控制在12小时；浓縮液效价单位控制在580Q062000u/ml。样品2:依据文献报道3所述的产氨棒杆菌生物合成法制得样品2。按辅酶A法定标准检测每lml含辅酶A的效价单位，样品1、样品2具体检测结果如下样品样品l样品2每lml含辅酶A的效价31825权利要求1、一种辅酶A的制备工艺，包括发酵和提取纯化两大部分，发酵部分分为微生物菌种选育、菌种发酵和酶促合成反应；提取纯化部分分为吸附分离、浓缩、分子筛层析、还原、沉淀，其特征在于在发酵部分的酶促合成反应阶段，向酶反应液中分批次加入公知量的前体物质即盐酸-半胱氨酸，泛酸钙、三磷酸腺苷二钠。2、如权利要求1所述的一种辅酶A的制备工艺，其特征在于在发酵部分的酶促合成反应阶段，向酶反应液中分3次、4次或5次加入公知量的前体物质。3、如权利要求1所述的一种辅酶A的制备工艺，其特征在于在发酵部分的酶促合成反应阶段，向酶反应液中分5次加入公知量的前体物质。4、如权利要求1所述的一种辅酶A的制备工艺，其特征在于在提取纯化部分的分离、浓縮阶段，采用DA210-B型非极性大孔树脂进行吸附分离。5、如权利要求1所述的一种辅酶A的制备工艺，其特征在于在提取纯化部分的还原阶段，用饱和的强碱溶液调节PH值，以巯基乙醇为还原剂进行还原。6、如权利要求2所述的一种辅酶A的制备工艺，其特征在于在提取纯化部分的还原阶段，用饱和的氢氧化钾、氢氧化钠或氢氧化锂溶液调节PH，值以巯基乙醇为还原剂进行还原。7、如权利要求2所述的一种辅酶A的制备工艺，其特征在于在提取纯化部分的还原阶段，用饱和的氢氧化锂溶液调节PH值，以巯基乙醇为还原剂进行还原。全文摘要本发明公开一种辅酶A的制备工艺，包括发酵和提取纯化两大部分，其特征在于在发酵部分的酶促合成反应阶段，向酶反应液中分批次加入公知量的前体物质即盐酸-半胱氨酸，泛酸钙、三磷酸腺苷二钠。在提取纯化部分的还原阶段，用饱和的强碱溶液调节pH值，以巯基乙醇为还原剂进行还原。本发明与现有技术相比提高了辅酶A的纯度，每1mg含辅酶A的效价均不低于300单位，比国家标准高出50单位；本品稳定性考察结果将贮存条件定为遮光，密封，在-20℃冷冻保存；并将有效期期限确定为18个月，比国家标准超出6个月。文档编号C12R1/15GK101230374SQ200810049249公开日2008年7月30日申请日期2008年2月20日优先权日2008年2月20日发明者崔凤云,李大平,杨小棉,王金成申请人:天津药业焦作有限公司