杂交瘤细胞afb1-2a4及其产生的黄曲霉毒素b1单克隆抗体的制作方法
【专利说明】杂交瘤细胞AFB1-2A4及其产生的黄曲霉毒素BI单克隆抗体
[0001]
技术领域
[0002]本发明涉及杂交瘤细胞株AFB1-2A4及其产生的黄曲霉毒素BI单克隆抗体。
【背景技术】
[0003]黄曲霉毒素(Aflatoxin，AF)是一种极强的剧毒物质，已被世界卫生组织的癌症研宄机构划定为I类致癌物。黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉中产毒菌株的代谢产物，普遍存在于霉变的粮食、饲料及其制品中。黄曲霉毒素B1、B2、G1及G2是粮食和食品中黄曲霉毒素主要存在形式，其中黄曲霉毒素BI的毒性和致癌性最强。黄曲霉毒素BI进入人体后，其主要靶器官为肝脏，急性中毒症状为恶心、呕吐、胃肠大出血而死亡。慢性中毒主要会引起肝癌，还可以诱发骨癌、肾癌、直肠癌等。
[0004]目前，检测黄曲霉毒素常用的仪器方法有薄层色谱法、高效液相色谱法、微柱层析法。这些方法测定的准确度较高，重复性较好，但往往需配备大型较昂贵的设备，费用高，对操作人员要求高，一般适于在国家或地区级研宄所或科研单位大型实验室中应用。酶联免疫法集合了抗原抗体反应的高特异性与酶促反应的高度敏感性。这种方法灵敏度高，比薄层法提高了近200倍；特异性强，荧光物质、色素、结构类似物对结果无干扰；而且回收率高，提取方法简单，可进行定性定量测定。要研宄建立针对黄曲霉毒素BI (AFBl)的任何一种免疫学检测技术，都必须先获得抗黄曲霉毒素BI (AFBl)的抗体。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的问题是提供杂交瘤细胞株AFBl - 2A4及其产生的黄曲霉毒素BI (AFBl)的单克隆抗体
本发明提供了杂交瘤细株AFBl - 2A4，该细胞株已于2014年12月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是，中国，北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研宄所，保藏编号为CGMCC N0.10200，分类命名为S/P20杂交瘤细胞。
[0006]抗黄曲霉毒素BI单克隆抗体由保藏编号为CGMCC N0.10200的杂交瘤细胞株AFB1-2A4分泌产生。该AFBl单克隆抗体可以识别黄曲霉毒素BI，对黄曲霉毒素BI的50%抑制浓度IC50为33.2 pg/mLo
[0007]抗黄曲霉毒素BI单克隆抗体在黄曲霉毒素BI测定中的应用。
[0008]本发明提供的杂交瘤细胞株AFB1-2A4单克隆抗体是采用三步法筛选获得的，其具体步骤是:以AFBl在羧甲基羟胺半盐酸盐(CMO)作用生成AFBl肟，在EDC和NHS存在的条件下和BSA偶联生成AFB1-BSA。用其免疫BLAB/c小鼠4次，最后一次加强免疫用2倍与前一次免疫剂量的AFB1-BSA，免疫3天后进行细胞融合。采用ELISA分两步法进行筛选融合细胞:第一步采用间接ELISA法筛选出仅能抗黄曲霉毒素BI而不抗载体蛋白BSA的阳性克隆；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性克隆培养液进行检测，采用AFBl作为竞争源，选择吸光度值低、灵敏度较高的阳性克隆进行有限稀释法继续克隆，克隆10天后采用同样的两步筛选法进行抗体检测，如此重复2次，最终筛选获得的杂交瘤细胞AFB1-2A4。
[0009]本发明提供的黄曲霉毒素BI单克隆抗体的制备方法，步骤如下:将获得的杂交瘤细胞株AFB1-2A4注射预先用弗氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，纯化处理后获得抗黄曲霉毒素BI的单克隆抗体。
[0010]上述纯化方法的具体操作为:腹水于4°C，3000r/min离心5min以上，吸取上清，将上清与2倍体积的醋酸盐缓冲液混合，边搅拌边缓慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸体积为33yL，室温混合30min，4°C静置2h以上，使其充分沉淀。然后4°C，12000r/min离心30min以上，弃沉淀，将得到的上清液用砂芯漏斗过滤后，加入1/10滤液体积的0.1mol/L ρΗ7.4的磷酸盐缓冲液，用2 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.4，4°C预冷I小时，缓慢加入0.277g/mL硫酸铵至硫酸铵终浓度为45%，4°C静置2h以上，然后40C 12000r/min离心30min，弃上清，将所得沉淀用原腹水体积1/10的0.01mol/L磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，用0.01mol/L磷酸盐缓冲液透析，将充分透析好的蛋白溶液加入等体积甘油，置-20°C冰箱中备用；
醋酸盐缓冲液:0.29g醋酸钠加入0.141mL醋酸，纯水定容至10mL ；
0.1mol/L磷酸盐缓冲液:0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，
0.02g磷酸二氢钾，加水定容至100mL。
[0011]0.01mol/L磷酸盐缓冲液:用纯水将0.1 mol/L磷酸盐缓冲液稀释10倍。
[0012]本发明的有益效果在于:
I本发明提供的杂交瘤细胞AFB1-2A4可以用于制备高效价的抗黄曲霉毒素BI单克隆抗体，将黄曲霉毒素BI小鼠腹水抗体酶联免疫吸附方法测定的效价达到3.12X106,即腹水稀释至3.12 X 16时溶液测定结果仍为阳性。
[0013]2本发明提供的黄曲霉毒素BI单克隆抗体灵敏度高、特异性好，对黄曲霉毒素BI的半抑制浓度IC50为33.2 pg/mL，与黄曲霉毒素B2的交叉反应率2.3%，与黄曲霉毒素Gl的交叉反应率9.9%，与黄曲霉毒素G2的交叉反应率0.5%，与黄曲霉毒素Ml的交叉反应率
1.6%ο
[0014]3本发明提供的抗黄曲霉毒素BI的单克隆抗体可用于测定黄曲霉毒素BI的含量。
【附图说明】
[0015]图1 AFB1-2A4单克隆抗体对AFBl的检测标准曲线。
【具体实施方式】
[0016]实施例1:杂交瘤细胞株AFB1-2A4的筛选
1.抗原的合成及动物的免疫
AFBl通过肟化，得到AFBl肟，再在EDC和NHS存在的条件下与载体蛋白发生偶联反应，得到相应的人工抗原。
[0017]AFBl肟的合成
将1.5毫克AFBI与3mg的CMO溶于2mL的甲醇一吡啶(1:1)溶液中，70 °C反应5小时。反应后将反应液挥干，用双蒸水溶解残留物。调整溶液的pH至3.0，用3mL乙酸乙酯提取AFBlO 3次。合并乙酸乙酯层，挥干，用0.5mL DMF重溶。得AFBl肟溶液。
[0018]人工抗原的合成
取 0.45mL AFB10，加入 30mg EDC 和 8.64mg NHS，再加入 1.5mL DMF，30°C反应过夜。反应液与3mL 0.1M PBS溶解的12.5mg BSA室温下反应2小时。反应完成后，3000rpm离心10分钟，上清用2L PBS透析3次，每次一天。最后将透析袋中的液体收集，_20°C保存。
[0019]人工抗原的鉴定
通过紫外光谱扫描法及质谱鉴定表明制备得到了黄曲霉毒素BI的完全抗原AFBl-BSA0
[0020]购买6周龄雌性BALB/c小鼠6只，免疫自行合成的黄曲霉毒素BI的完全抗原AFB1-BSAo第一次免疫将完全抗原AFBl-BSA与等量弗氏完全佐剂混合乳化，然后小鼠颈背部皮下多点注射。第二次免疫于首免3周后进行，采用弗氏不完全佐剂与等体积完全抗原AFBl-BSA乳化，免疫剂量与方法与首免相同。第三次免疫与第二次免疫间隔时间3周，免疫剂量和方法与第二次相同。第四次免疫于第三次免疫3周后进行，免疫方式及免疫剂量与第三次免疫相同，每次免疫剂量为每鼠30yg。前3次每次免疫后一周，眼周采血，分离血清，采用间接ELISA法监测小鼠血清抗体效价。第4次免疫后3天，尾静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法监测小鼠血清抗体效价，并用间接竞争ELISA法测定小鼠血清灵敏度，选择效价、灵敏度均相对较高的血清对应的小鼠进行最后一次加强免疫，免疫剂量为之前的2倍。
[0021]2.细胞融合
最后一次加强免疫3天后，米用50% (重量百分比)的聚乙二醇(PEG，分子量1460)作融合剂，按常规方法进行细胞融合。具体步骤如下:
将BALB/c小鼠脱颈处死，浸泡于75%酒精中。约3 min后放入超净台。用镊子提起小鼠腹部皮肤，用手术剪剪一个小口(注意勿剪破腹膜)，然后用镊子向头、尾两个方向撕开皮肤，充分暴露腹膜。换用干净剪刀剪开腹膜，取出脾脏，放入已盛有1mL不完全培养液的平皿中清洗一次，并剥去结缔组织。将脾脏转入另一盛