一种间充质干细胞的培养基及其大规模培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及干细胞领域，具体涉及一种间充质干细胞的培养基及其大规模培养方 法。
【背景技术】
[0002] 干细胞（Stem cell)是一类具有自我复制能力（self-renewing)的多潜能细胞。 在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。间充质干细胞（mesenchymal stem cells， MSCs)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，间充质干细胞具有干 细胞的共性，即自我更新、多向分化和归巢的能力。在特定的机体外分化环境下，能够诱导 分化为神经、心脏、骨、软骨、脂肪、上皮等多种组织细胞，被认为是细胞治疗技术的最有希 望的来源细胞之一，是近几年研宄的热点。间充质干细胞作为重要的再生医学资源，在临床 的疾病治疗领域将有非常重要的应用价值。
[0003] 大量研宄证实，间充质干细胞可以从骨髓分离得到，也存在于其他不同组织和脏 器，如肌肉、脂肪组织、脐血、脐带、胎盘、血管等。但成体中的间充质干细胞会随着年龄的增 加，含量也会逐渐降低，而且增殖和分化的能力也会相应的下降。所以，在临床应用上，需要 克服间充质干细胞细胞数量少的技术瓶颈，研宄一种可大规模培养间充质干细胞的方法， 对分离得到的原代间充质干细胞进行高效扩增显得尤为重要。
[0004] 目前，现有技术中没有较为成熟的关于间充质干细胞的大规模培养培养方法。在 间充质干细胞的常规培养中，最常见的培养体系是采用DMEM/F12培养基加上体积比为 10%的胎牛血清（FBS)进行间充质干细胞的体外培养与扩增，但是间充质干细胞在传到5 代之后，细胞形态即发生了改变，部分细胞出现了老化现象。而且FBS虽然可为间充质干细 胞提供一些必要的营养物质，但FBS属于动物源性物质，成分比较复杂，在临床应用上存在 潜在的风险，也增加了细胞污染的几率。而且FBS是一种价格比较高的生物制品，在间充质 干细胞的大规模培养中，无疑会大大增加生产的成本。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种间充质干细胞的 培养基及其大规模培养方法，本发明所述培养基克服MSC在体外进行扩增培养时对FBS的 依赖，避免FBS在临床应用上的潜在风险，降低细胞污染的几率，同时对MSC的扩增起到促 进作用，延缓MSC在体外培养的老化速度。本发明所述间充质干细胞的大规模培养方法可 获得大量高纯度间充质干细胞，且能保持间充质干细胞良好的干细胞特性，适用于所有类 型MSC的大规模培养。
[0006] 为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] -种间充质干细胞的培养基，包括无血清培养基和表皮细胞生长因子和血小板 衍生因子，其中所述表皮细胞生长因子浓度为5ng/mL~10ng/mL，血小板衍生因子浓度为 5ng/mL ~10ng/mL〇
[0008] 本发明所述间充质干细胞的培养基在无血清培养基的基础上添加表皮细胞生长 因子（EGF)和血小板衍生因子（PDGF)，低浓度的EGF与TOGF联合使用，可起到协同促进MSC 的增殖作用，并延缓MSC在培养过程中的老化现象，使MSC在传到第10代以上时，仍可以保 持较好的增殖及分化能力，保持原有的间充质干细胞特性。
[0009] 在一些优选实施方案中，所述表皮细胞生长因子浓度为5ng/mL。
[0010] 在一些优选实施方案中，所述血小板衍生因子浓度为5ng/mL。
[0011] 在一些实施方案中，所述无血清培养基为lonza Ultra⑶LTURE MEDIUM无血清培 养基。
[0012] 本发明还提供了一种间充质干细胞的大规模培养方法，取原代分离培养的P1代 间充质干细胞，用间充质干细胞的培养基调整接种密度为2X10 4/mL-3X105/mL，置于5% C02、37°C培养箱培养，当细胞融合度达到80%~90%后记为P2代细胞，重复传代至P10代 细胞；所述间充质干细胞的培养基包括无血清培养基和表皮细胞生长因子和血小板衍生 因子，其中所述表皮细胞生长因子浓度为5ng/mL~10ng/mL，血小板衍生因子浓度为5ng/ mL ~10ng/mL〇
[0013] 本发明所述间充质干细胞的大规模培养方法，适用于所有类型MSC的大规模培 养，所述间充质干细胞可以为骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞、 胎盘间充质干细胞、牙髓间充质干细胞或外周血间充质干细胞。
[0014] 在一些实施方案中，所述无血清培养基为lonza Ultra⑶LTURE MEDIUM无血清培 养基。
[0015] 在一些实施方案中，所述P1代间充质干细胞的原代分离培养方法具体为组织块 剪碎，加入完全培养基，于37°C，5 % 0)2静止培养，期间补加完全培养基，待组织块有细胞爬 出后去掉组织块，清洗后加入完全培养基继续培养，当细胞融合度达到80 %~90 %后，去 掉细胞培养上清，清洗后加入含胰蛋白酶消化液消化，完全培养基终止消化，离心，弃上清， 用完全培养基重悬。
[0016] 其中，在一些实施方案中，所述P1代间充质干细胞的原代分离培养方法中所述完 全培养基包括无血清培养基和表皮细胞生长因子和血小板衍生因子，其中所述表皮细胞生 长因子浓度为5ng/mL~10ng/mL，血小板衍生因子浓度为5ng/mL~10ng/mL。
[0017] 在一些实施方案中，所述P1代间充质干细胞的原代分离培养方法中所述含胰蛋 白酶消化液中胰蛋白酶浓度为0.25v/v%，所含EDTA浓度为0. 04v/v%。
[0018] 在一些实施方案中，所述P1代间充质干细胞的原代分离培养方法中所述原代分 离培养方法中消化液消化的时间为1 _2min。
[0019] 在一些实施方案中，所述P1代间充质干细胞的原代分离培养方法中所述间充质 干细胞来源与脐带组织。所述脐带可以取自产后弃置的脐带组织，采用含有双抗的PBS保 存。所述含有双抗的PBS为含青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲液，其中青霉素工作浓度为 100U/mL，链霉素工作浓度为0. lmg/mL。
[0020] 在一些实施方案中，所述P1代间充质干细胞的原代分离培养方法中所述脐带预 先清洗表面血迹并消毒。在一些具体实施例中，所述脐带用50mL~150mL无菌的PBS清洗 脐带表面血迹，用50mL~150mL75%乙醇消毒脐带表面，再用50mL~150mL PBS清洗数遍 尽量去除血迹。
[0021] 在一些优选实施方案中，所述脐带预先去除最外层膜及静脉跟动脉后剪碎以充 分与培养基接触。在一些具体实施例中，脐带去除最外层膜及静脉跟动脉后剪至大小为 1mm 3~3mm 3的小块，以0. 5cm~lcm的间隔把组织块分布于培养皿中。
[0022] 在一些实施方案中，所述培养前完全培养基的加入量为0. 07mL/cm2-0. lmL/cm2。
[0023] 在一些优选实施方案中，在培养期间需要补加完全培养基直至组织块有细胞爬 出。在一些具体实施例中，所述培养期间补加完全培养基的加入量为〇. 〇7mL/cm2-〇. lmL/ cm2。
[0024] 本发明所述P1代间充质干细胞的原代分离培养方法中，在组织块有细胞爬出后 去掉组织块，并对细胞进行清洗。所述清洗可以采用PBS清洗。
[0025] 本发明所述P1代间充质干细胞的原代分离培养方法中，在清洗后加入完全培养 基继续培养，至细胞融合度达到80 %~90 %。在一些实施方案中，所述清洗后完全培养基 的加入量为 〇? 15mL/cm2-〇. 21mL/cm2。
[0026] 在一些实施方案中，本发明所述P1代间充质干细胞的原代分离培养方法中，所述 终止消化的完全培养基的加入量为消化液体积的5倍~10倍。
[0027] 在一些实施方案中，本发明所述P1代间充质干细胞的原代分离培养方法中所述 离心为200g_400g离心5min。
[0028] 在一个具体实施例中，比较H)GF、EGF不同添加方式的间充质干细胞的培养基对 细胞生长状态、形态变化及细胞总数的影响，结果显示EGF、TOGF联合使用的细胞在形态上 较好，为梭形、成纤维状，形态也较均一。而没有加入EGF、TOGF的细胞密度比较稀疏，形态 上有较大的改变，部分细胞已经开始出现分化现象。且EGF、PDGF联合使用可明显促进脐带 MSC的增殖。EGF、PDGF两个联合使用的浓度，在较低浓度范围（5 y g/L~10 y g/L)均可达 到较好的促增殖效果，将EGF、PDGF的浓度由5 y g/L提高到10 y g/L之后，所起到的促进增 殖的作用并没有明显的差异，而在细胞形态上，也无明显差别，均为梭形、成纤维状细胞，状 态都较好。表明低浓度的EGF及TOGF联合使用，不仅可以促进脐带MSC的增殖，而且可抑 制该细胞在体外培养的分化。
[0029] 在一个具体实施例中，考察本发明所述间充质干细胞的大规模培养方法培养的间 充质干细胞的增殖能力，由细胞生长曲线图可知本发明所述间充质干细胞的大规模培养方 法培养的间充质干细胞〇~2天为适应期，3~6天为对数生长期，细