脂肪间充质干细胞及其制剂的制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别涉及脂肪间充质干细胞及其制剂的制备方法和用 途。
【背景技术】
[0002] 脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs)是近年来从脂肪组织中分离 得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。研宄发现ADSCs细胞能够在体外稳定增殖且衰亡 率低，同时它具有取材容易、少量组织即可获取大量干细胞，适宜大规模培养，对机体损伤 小等优点，而且其来源广泛，体内储备量大，适宜自体移植，逐渐成为近年来新的研宄热点 之一。目前脂肪干细胞主要运用于脂肪组织移植中的丰胸、除皱等美容行业，其在促进移植 后脂肪细胞的存活率有很大的提高。另脂肪干细胞经体外大规模培养后，激活干细胞功能， 促进分泌VEGF、BFGF、IGF等细胞因子?
[0003] 衰老是生物随着时间的推移，自发的必然过程，它是复杂的自然现象，表现为结构 和机能衰退，适应性和抵抗力减退。实质是身体各部分器官系统的功能逐渐衰退的过程。
[0004] 在正常生理过程中，人体每天都有大量细胞死亡，同时伴有大量细胞的新生，以维 持各种组织和器官的完整性，保证功能处于正常状态，而发挥细胞新生功能的是体内的各 种干细胞。随着年龄的增长，当体内的干细胞量减少，使细胞的死亡与新生失去平衡，干细 胞无法满足机体对新生细胞的需求，就会导致组织器官功能的减退、疾病发生，甚至死亡。 所以及时补充体内干细胞量或激活、修复体内衰老细胞以维持体内细胞死亡与新生的平衡 是抗衰老的重要途径。
[0005] 目前主要采用移植植物和蛋白诱导性造血干细胞来达到抗衰老的目的。但存在如 下缺点：1、诱导得到的主要是造血干细胞，在功能上局限于血液系统；2、培养得到的造血 干细胞纯度在5-40 %，纯度过低。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明提供一种脂肪间充质干细胞及其制剂的制备方法和用途，获得 的脂肪间充质干细胞制剂，脂肪间充质干细胞纯度高达90%以上，能更好的发挥干细胞的 功能，达到抗衰老目的。
[0007] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0008] 本发明提供了一种脂肪间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤：
[0009] 步骤1 :获得脂肪，预处理、酶解、离心，收集沉淀，获得脂肪间充质干细胞；
[0010] 步骤2 :培养所述脂肪间充质干细胞，当所述脂肪间充质干细胞生长至80%融合 时，弃培养液，加PBS清洗，再加EDTA-胰酶溶液消化，终止消化、离心，传代培养。
[0011] 在本发明的一些具体实施方案中，脂肪间充质干细胞的制备方法步骤1中所述预 处理为加PBS洗涤、离心。
[0012] 优选的，离心的条件为1500rpm离心5min。
[0013] 在本发明的一些具体实施方案中，脂肪间充质干细胞的制备方法步骤1中所述酶 解为采用0. 5% I型胶原酶，37°C、100R消化50min ;所述I型胶原酶与所述脂肪的体积比 为 0? 5 ~1:1〇
[0014] 在本发明的一些具体实施方案中，脂肪间充质干细胞的制备方法步骤2所述培养 采用完全培养基调整细胞密度为lX105cell/mL，添加1 y g/mL EGF，于5% C02、37°C、饱和 湿度为95%的条件下培养；所述完全培养基包括DMEM/F12和10% FBS。
[0015] 作为优选，步骤2所述培养48h后用10mL PBS清洗，重复2次，取10mL的细胞悬 液添加100uL的lug/mL EGF，于5% C02、37°C、饱和湿度为95%的条件下继续培养；所述脂 肪间充质干细胞的悬液与所述EGF的体积比为10:0. 1。
[0016] 在本发明的一些具体实施方案中，脂肪间充质干细胞的制备方法EDTA-胰酶溶液 中EDTA-胰酶的浓度为0. 25w/v%，所述脂肪间充质干细胞贴壁面积与EDTA-胰酶溶液的比 例为：每10cm2的面积添加0. 5~lml EDTA-胰酶溶液，所述消化的时间为1~2min。
[0017] 作为优选，步骤2所述终止消化具体为加FBS终止消化，FBS与所述脂肪间充质干 细胞的悬液的体积比为1:10。
[0018] 作为优选，步骤2所述离心为1500rpm/min离心5min。
[0019] 在本发明的一些具体实施方案中，脂肪间充质干细胞的制备方法中所述传代培养 具体为加入完全培养基和EGF，于5% C02、37°C、饱和湿度为95%的条件下培养；所述完全 培养基包括DMEM/F12和10% FBS ;所述细胞传代培养密度为lX105cell/mL。。
[0020] 本发明还提供了一种脂肪间充质干细胞制剂的制备方法，包括如下步骤：
[0021] 步骤1 :如权利要求1至6任一项所述的制备方法获得的脂肪间充质干细胞；
[0022] 步骤2 :将所述脂肪间充质干细胞传代培养至P3代时，收集上清液，更换培养液；
[0023] 步骤3 :重复步骤2,合并上清液，超滤浓缩，冻干，获得上清液冻干粉；
[0024] 步骤4 :将所述脂肪间充质干细胞传代培养至P3代时，经胰酶消化，收集获得干细 胞，以此104溶液裂解，离心，收集上清液；
[0025] 步骤5 :将步骤4获得的上清液经碱液中和，离心，收集上清液；
[0026] 步骤6 :将步骤5获得的上清液与活性炭混合、洗涤、碱液洗脱后，调节pH值为中 性，获得干细胞提取物；
[0027] 步骤7 :将步骤3获得的上清液冻干粉与步骤6获得的干细胞提取物混合。
[0028] 作为优选，步骤3超滤采用0? 45um、0. 22um滤膜过滤超滤系统过滤3kd以下粒径 小分子。
[0029] 作为优选，步骤3获得的上清液冻干粉中，每lmg中蛋白因子的含量为0. 5~ 0. 8mg〇
[0030] 作为优选，步骤4中胰酶的浓度为0. 25w/v%，所述脂肪间充质干细胞贴壁面积与 EDTA-胰酶的比例为：每10cm2的面积添加0. 5~lml EDTA-胰酶。
[0031] 作为优选，步骤4中HC104的质量分数为40%，HC10 4溶液与所述脂肪间充质干细 胞的体积比为1:5。
[0032] 作为优选，步骤4中获得干细胞的个数为1-1. 2 X 108个。
[0033] 作为优选，步骤4中离心的条件为1000rpm/min-1500rpm/min离心5min。
[0034] 作为优选，步骤5中碱液为K0H溶液，浓度为0. 05mol/mL。
[0035] 作为优选，步骤5中离心的条件为1000rpm/min-1500rpm/min离心5min。
[0036] 作为优选，步骤6中干细胞提取物的浓度为5~20yg/mL。
[0037] 在本发明的一些具体实施方案中，脂肪间充质干细胞制剂的制备方法步骤3获得 的上清液冻干粉与步骤6获得的干细胞提取物的质量比为50~100 :1。
[0038] 一次分离培养，可以获得100支上清液冻干粉和100ml干细胞提取物溶液；每支冻 干粉0. 5-2mg，每毫升干细胞提取物溶液含干细胞提取物5-20ug，按照1支上清液冻干粉溶 解lml无菌水后再与lml干细胞提取物溶液混合，得到的质量比为50-100:1。
[0039] 作为优选，将步骤3获得的上清液冻干粉溶于无菌水，制得上清液稀释液，稀释倍 数为5~10倍，上清液稀释液的浓度为0. 5-2mg/ml;再与步骤6获得的干细胞提取物混合， 上清液稀释液与步骤6获得的干细胞提取物的体积比优选为1: 1，上清液稀释液的有效成 分与步骤6获得的干细胞提取物中有效成分的质量比为5~8 :1。
[0040] 本发明还提供了上述脂肪间充质干细胞制剂的制备方法获得的脂肪间充质干细 胞制剂。
[0041] 本发明还提供了上述脂肪间充质干细胞制剂在制备抗衰老的药物、食品、保健品、 化妆品中的应用。
[0042] 本发明提供了一种脂肪间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤：获得脂肪，预处 理、酶解、离心，收集沉淀，获得脂肪间充质干细胞；培养所述脂肪间充质干细胞，当所述脂 肪间充质干细胞生长至80%融合时，与EDTA-胰酶混合消化，终止消化、离心，传代培养。流 程如图1所示。与现有技术相比，本发明具有以下优势：
[0043] 1、培养得到的干细胞纯度高；
[0044] 2、回收脂肪间充质干细胞培养过程中分泌出的各类因子，可以显著促进表皮细胞 的增殖，表明能加快表皮细胞的新生和更替，达到显著的抗衰老效果。
【附图说明】
[0045] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0046] 图1示本发明提供的脂肪间充质干细胞及其制制剂的制备方法流程图；
[0047] 图2示脂肪间充质干细胞流式鉴定图。
【具体实施方式】
[0048] 本发明公开了脂肪间充质干细胞及其制剂的制备方法和用途，本领域技术人员可 以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本 领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经 通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文 所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0049] 本发明提供的脂肪间充质干细胞及其制剂的制备方法和用途中所用原料及试剂 均可由市场购得。
[0050] 下面结合实施例，进