脂肪间充质干细胞的构建方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，具体是一种脂肪间充质干细胞的构建方法与应用。
【背景技术】
[0002]肾脏移植是目前治疗终末期肾病最有效方法，近年来，我国移植肾一年及五年存活率大幅度提高，患者生活质量得到明显改善。为了保证器官移植的临床效果，术后患者必须长期使用免疫抑制剂。但这些药物的免疫抑制作用是非特异性的，影响受体全身免疫细胞的功能，产生许多不良反应，包括:增加术后感染及恶性肿瘤的风险，引起心血管疾病，导致代谢紊乱和对移植物直接产生毒副作用等，最终导致移植物失去功能。因此，如果能诱导受体产生针对供体的特异性免疫耐受，就可以减少甚至停用免疫抑制剂，使移植物维持良好功能并长期存活。随着干细胞工程和基因工程等技术手段的相关理论、实践的不断完善，基因治疗和细胞治疗逐渐成为促进移植物成活的两个重要手段。
[0003]移植排斥反应的本质是体内免疫系统对外来抗原的免疫应答，受体T细胞作为同种异体免疫排斥反应的主要效应细胞，阻断共刺激分子(信号通路)可诱导T细胞无能，可以诱导免疫耐受，促进异体移植物成活，对于预防预防移植排斥反应具有很大的应用前景，有望成为解决移植排斥的新靶点。
[0004]0X40是主要表达于活化的⑶4+ T细胞表面的跨膜糖蛋白，为肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员；0X40L是表达于成熟树突状细胞(DC)、巨噬细胞、活化的T、B细胞等细胞表面的跨膜糖蛋白，为TNF超家族成员。0X40-0X40L共刺激信号通路主要在免疫应答的后期起维持和调节共刺激信号的作用，能上调IL-2的产生，促进T淋巴细胞的活化、增殖和细胞因子分泌。我们前期研究发现，0X40可以作为预测肾移植术后急性排斥反应的一个分子标志物，特异性阻断该共刺激信号通路明显抑制移植术后急性排斥患者Thl和Th2细胞因子的分泌，有利于诱导免疫耐受的产生。这使得0X40有可能成为一个潜在新的药物作用靶点。
[0005]ICOS是⑶28超家族中的一个成员，与⑶28和⑶40信号通路不同的是，ICOS需要T细胞受体信号的诱导，局限表达于活化后的T细胞膜上。ICOSL (B7h)是B7家族成员，可表达于包括B细胞、DC等APC上。ICOS通路可以通过激活PI3K信号促进T细胞活化，增强T细胞回忆增殖反应。目前已证实IC0S-1C0SL通路在器官移植排斥反应中扮演重要角色，如阻断⑶28-B7和⑶40-⑶40L信号通路虽然可以抑制急性排斥反应的发生，但却不能有效阻止慢性排斥反应，而阻断ICOS共刺激分子，不仅可以明显抑制急性移植排斥，还可以防止移植物血管硬化，有效地抑制慢性排斥反应，可明显延长移植物的存活时间。
[0006]器官移植免疫排斥反应的发生机制是复制的，到目前为止尚不能通过特异性地阻断某一共刺激通路来完全获得免疫耐受，因此，联合应用免疫调节因子共同诱导和维持免疫耐受是一条更佳的途径。(联合阻断共刺激通路诱导免疫耐受的效果均好于单一通路阻断)。
[0007]近年来，间充质干细胞(MSC)因具有组织修复、多向分化潜能、低免疫原性、向移植器官定向迁移以及独特的免疫调节功能等特性，使其成为直接诱导受体对供体特异性免疫耐受的细胞治疗工具。目前已有将MSC应用于临床的报道，如Tan等报道骨髓来源MSC治疗降低肾移植术后6个月急性排斥反应的发生率，提示MSC有可能成为新的诱导耐受的方法。Peng等报道供体骨髓来源MSC输注可以在保证肾移植患者安全的情况下减少传统免疫抑制剂的用量，减少药物性肾损伤。此外，MSC还可作为基因治疗的载体细胞，接受多种外源基因转染并在体内分化后仍能保持良好的生物学特性，使转染基因能稳定而持续的表达，以达到治疗的目的。脂肪来源的间充质干细胞(ADSCs)作为一种干细胞的新来源，具有一定的潜在的优越性。ADSCs具有下列优点:1.取材方便，这是ADSCs—个最大的优势。一方面脂肪组织在体内分布广泛，储量丰富；另一方面吸脂手术属于技术成熟的常规手术，手术风险小，患者痛苦少，这一点尤其利于临床应用；2.从临床角度出发，在短时间内更容易获得大量的ADSCs ;3.ADSCs属于自体的成体干细胞，使用不涉及伦理道德问题。因此认为ADSCs能有效地解决组织再生及组织工程的种子细胞来源问题，是一种具有临床应用前景的种子细胞。
[0008]单独应用ADSCs存在细胞数量有限，以及ADSCs在体内作用速度较慢、分泌的细胞因子有限的不足，并不能维持移植物的长期存活。
[0009]基因治疗的核心和关键是通过适当的方法将外源基因导入细胞，并使其得到可控的适量表达。传统的电转染或脂质体介导的转染需要摸索的参数较多，如电压、脉冲时间及应用比例等，核转染技术的参数已经根据不同的细胞种类而预先设定，提高细胞转染的效率，并大大减少了预实验的时间。因此，就转染效率及操作过程而言，核转染是转染ADSCs比较理想的方法。
【发明内容】
[0010]本发明就是为了解决现有技术中单独应用ADSCs存在细胞数量有限，以及ADSCs在体内作用速度较慢、分泌的细胞因子有限的不足，不能维持移植物的长期存活等问题，而提供了一种脂肪间充质干细胞的构建方法与应用。
[0011]本发明是按照以下技术方案实现的
一种脂肪间充质干细胞的构建方法，其是按如下步骤实现的:
a.聚合酶链式反应克隆获得大鼠0X40、大鼠ICOS胞外区编码序列、人IgGFe片段以及融合蛋白连接序列；
b.首先将pcDNA3.1 (+)与融合蛋白连接序列连接构建重组质粒，并命名为pcDNA3.1 (+)/linker，再分别将大鼠0X40及大鼠ICOS胞外区编码序列和人IgG Fe片段插入 pcDNA3.1 (+)/linker 质粒，得到 pcDNA3.1 (+)/ICOS-1gG Fe 和 pcDNA3.1 (+)/0X40-1 gGFe重组质粒；
c.利用核转染技术将pcDNA3.1 (+)/ICOS-1gG Fe 和 pcDNA3.1(+) /0X40-1 gG Fe 重组质粒转染大鼠ADSCs，得到0X40Ig和ICOSIg基因修饰的脂肪间充质干细胞；
d.采用Westernblot检测目的蛋白在大鼠ADSCs细胞中的表达。
[0012]所述脂肪间充质干细胞的构建方法，其所述聚合酶链式反应克隆获得大鼠0X40、大鼠ICOS胞外区编码序列、人IgG Fe片段以及融合蛋白连接序列所用引物分别为:
0x40-S:ACGGGATCCACCACCATGGTTACAGTGAAGCTCAAC,0x40-A:CGGAATTCAGGGCCCTCAGGAGCCACC ；
Icos-S:ACAGGATCCACCACCATGGAACTCAATGACTTGGCC,
Icos-A:CGGAATTCGGGTAACCAAAGCTTCAGCTGG ；hIgGFc-S:GTCAGCTCGAGGCAAGCTTCAAGGGCC，hIgGFc-A:GCTCTAGACTATTTACCCGGAGACAGGGAGAG ；
Linker-Top:AATTCGGATCTGGCGGAAGCGGCGGAC,
Linker-Bottom:TCGAGTCCGCCGCTTCCGCCAGATCCG。
[0013]所述脂肪间充质干细胞的构建方法，其中所述的0X40的核酸序列如Seq ID N0:1所示的序列；
所述ICOS的核酸序列如Seq ID N0:2所示的序列；
所述融合蛋白连接序列如Seq ID N0:3所示的序列；
所述人IgG Fe段核酸序列如Seq ID N0:4所示的序列。
[0014]如权利要求1所述的脂肪间充质干细胞在制备诱导器官移植免疫耐受药物中的应用。
[0015]这样设计的本发明，得到0X40Ig和ICOSIg在ADSCs中的高表达，该ADSCs不仅保持自身的免疫调节作用，同时又增加了对T淋巴细胞活化过程中0X40-0X40L、IC0S-1C0SL共刺激通路的阻断，赋予该细胞更强的免疫调节作用，提高基因治疗和细胞治疗二者相互协同、相互促进的作用，为针对共刺激通路的靶向免疫治疗提供新的调控点，为诱导间充质干细胞介导的免疫耐受奠定了基础，为临床应用ADSCs防治肾移植排斥反应、诱导器官移植长期存活提供新的解决方法和实验依据，并应用前景广阔。
【附图说明】
[0016]图1是重组质粒构建示意图；
图 2 是pcDNA3.1 (+)/Icos-1gG Fe和 pcDNA3.1 (+)/0x40_IgG Fe质粒的酶切鉴定电泳图；
图3是ICOS-1gG Fe重组质粒部分测序图；
图4是0X40-1gG Fe重组质粒部分测序图；
图5是Western blot检测ICOS-1gG Fe和0X40-1 gG Fe融合蛋白在ADSCs细胞中的表达不意图；
图6是异基因混合淋巴细胞反应抑制淋巴细胞增殖能力示意图；
图7是再次异基因混合淋巴细胞反应抑制细胞增殖能力示意图。
【具体实施方式】
[0017]下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的详细说明。
[0018]一.pcDNA3.1 (+)/ICOS-1gG Fe 和 pcDNA3.1 (+) /0X40-1 gG Fe 重组质粒构建
1.引物设计
根据NCBI数据库，大鼠ICOS胞外区编码序列如下:
GAACTCAATGACTTGGCCAATCACAGGATGTTTTCGTTTCACGATGGAGGTGTACAGATTTCTTGTAACTA
CCCTGAGACTGTCCAGCAGTTAAAAATGCAGTTGTTCAAAGACAGAGAAGTCCTCTGCGACCTCACCAAGACCAAGGGAAGCGGAAACACCGTGTCCATCAAGAATCCGATGTCCTGTCCATATCAGCTGTCCAACAACAGTGTCTCTTTTTTCCTAGACAACGCAGACAGCTCCCAGGGCAGCTACTTTTTATGCAGCCTGTCGATTTTCGACCCACCCCCTTTTCAAGAAAAGAACCTTAGTGGAGGATATTTGCTTATTTATGAATCCCAGCTTTGTTGCCAGCTGAAGCTTTGGTTACCC大鼠0X40胞外区编码序列如下:
GTTACAGTGAAGCTCAACTGTGTTAAAGATACCTACCCCAGTGGTCACAAGTGCTGTCGTGAGTGCCAGCCAGGCCATGGTATGGTGAGCCGCTGTGATCACACCAGGGACACTGTATGTCATCCATGTGAGCCTGGCTTCTACAATGAGGCTGTCAATTACGACACCTGCAAGCAGTGTACACAGTGCAACCACCGAAGTGGAAGTGAACTCAAGCAGAACTGCACACCTACTGAGGATACTGTCTGCCAGTGTAGACCAGGCACCCAACCCCGGCAAGACAGCAGCCACAAGCTTGGAGTTGACTGTGTTCCCTGCCCCCCTGGCCACTTTTCTCCAGGCAGCAACCAAGCCTGCAAGCCCTGGACCAATTGTACCTTATCTGGAAAGCAGATCCGCCACCCAGCCAGTAACAGCTTGGACACAGTCTGTGAAGACAGAAGCCTCCTGGCCACACTGCTCTGGGAGACCCAGCGCACTACATTCAGGCCAACCACTGTCCCGTCCACCACAGTCTGGCCCAGGACTTCTCAGTTGCCCTCTACACCCACCTTGGTGGCTCCTGAGGGCCCT融合蛋白连接序列如下:
GGATCTGGCGGAAGCGGCGGA人IgG Fe段编码序列如下:
GCAAGCTTCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGC
CCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGC
GTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAG
CTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCA
AATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTC
CCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGA
AGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCA