一种用于治疗糖尿病的干细胞制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于干细胞研究领域，具体是一种用于治疗糖尿病的干细胞制剂及其制备 方法。
【背景技术】
[0002] 糖尿病是一种因体内膜岛素绝对或者相对不足所导致的一系列临床综合症，主要 包括I型和II型糖尿病。近年来，糖尿病发病率呈上升趋势，而且更趋年轻化。预计到2025 年，世界范围内将有3. 34亿人次患有糖尿病，糖尿病已成为威胁人类健康的一大顽疾。不 同类型的糖尿病都会导致膜腺中的目细胞不能产生足量的膜岛素 W降低血糖的浓度，导 致高血糖症的发生。目前的治疗方法中，药物治疗虽然能有效降低血糖，但不能有效修复膜 岛功能；注射膜岛素虽能控制症状、延缓和减少并发症的发生，却不能使糖尿病彻底治愈， 且长期使用膜岛素会产生诸如失明、肾衰、肥胖等严重的并发症W及产生膜岛素抵抗，另外 每天注射膜岛素本身也给患者带来极大的痛苦，给患者、家庭和社会带来沉重的经济负担； 膜岛细胞移植虽然是一个有效的治疗策略，然而面临的问题依然是供体缺乏及免疫排斥等 医学与伦理学问题。
[0003] 近年来，干细胞研究为各种疾病的治疗提供了一种新的手段。干细胞是原始且未 充分分化的细胞，具有再生各种组织器官的潜在功能，因而为组织器官的再造移植和重大 疾病的治疗提供了希望。间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs)起源于中胚层， 在骨髓、厮带、厮血、脂肪等多种组织和器官中均可分离获得，具备干细胞的自我扩增和多 向分化性，在发育的不同阶段和特定环境条件下，能分化为多种间质起源的组织细胞，如成 骨、软骨和脂肪细胞，也能横向分化为肌细胞、神经细胞、血管内皮细胞、肝膜细胞等多种其 他组织细胞。MSCs兼具再生、修复和免疫调节等多方面的作用。厮带来源的间充质干细胞 (Umbilical-Derived Mesenchymal Stem Cells, UMSCs)是存在于厮带沃顿胶和血管周围 组织中的间充质干细胞，与来源于骨髓的间充质干细胞相比，UMSCs具有更加显著的优势， 包括；采集方便为无创性操作；来源于胎儿厮带的间充质干细胞比成人骨髓间充质干细胞 更幼稚，增殖和分化潜能更大；厮带来源丰富，可W进行规模化生产。送些优势使其在治疗 糖尿病方面展现出更广阔的应用前景。
【发明内容】
[0004] 为解决现有治疗糖尿病方法的不足，W及获取干细胞过程中涉及到的来源受限和 伦理问题，本发明提供一种用于治疗糖尿病的干细胞制剂及其制备方法。
[0005] 本发明为实现其目的所采用的技术方案是：
[0006] -种用于治疗糖尿病的干细胞制剂，该干细胞制剂包含从人厮带中分离提取的间 充质干细胞，该间充质干细胞经诱导后能够分化成膜岛目细胞。
[0007] 进一步的，所述间充质干细胞的细胞表面标记CD73、CD90、CD105的表达均高于 95%，细胞表面标记CD14、CD34、CD45、CD19和HLA-DR的表达均低于3%。
[0008] 进一步的，所述间充质干细胞是在分离提取后进一步经体外传代培养的干细胞。
[0009] 进一步的，所述间充质干细胞在显微镜下呈长梭形，包浆透亮，胞体小，有立体感。
[0010] 进一步的，所述间充质干细胞具有向成骨方向分化和向成脂方向分化的多向分化 潜能。
[0011] 一种制备所述的用于治疗糖尿病的干细胞制剂的方法，包括W下步骤：
[0012] (1)从厮带中分离提取间充质干细胞；
[0013] (2)间充质干细胞的原代培养；
[0014] (3)间充质干细胞的传代培养；
[0015] (4)将步骤（3)获得的间充质干细胞制成干细胞制剂；
[0016] (5)干细胞制剂的质量检测。
[0017] 进一步的，所述间充质干细胞的分离提取包括W下步骤；在超净工作台中操作，将 新鲜获取的厮带用己醇进行消毒，再用生理盐水清洗厮带，分离剥除厮带血管，获得华通氏 胶部分。
[0018] 进一步的，所述间充质干细胞的原代培养包括W下步骤：将华通氏胶剪碎，稀释后 种瓶，在二氧化碳培养箱中采用组织贴壁法培养，通过全量换液逐渐去除未贴壁细胞，待细 胞融合度达到70-80%即可收获原代细胞。
[0019] 进一步的，所述干细胞制剂的质量检测包括细菌、真菌、支原体、病毒、内毒素、热 源检测及细胞活性检测。
[0020] 本发明的有益效果是；本发明W厮带为干细胞的来源，经过提取分离、原代培养、 传代培养并制成干细胞制剂，利用流式细胞仪检测细胞的表面标记证明送是一类低免疫原 性的干细胞，通过实验表明所得间充质干细胞能够增殖、具有多向分化潜能，最重要的是， 它能够诱导分化成膜岛目细胞，从而用于治疗糖尿病。本发明制剂中的干细胞来自厮带， 采集方便，为无创性操作；所得间充质干细胞比其他的间充质干细胞更幼稚，增殖和分化潜 能更大；厮带来源丰富，可W进行规模化生产；不受伦理限制，免疫原性低，在治疗糖尿病 领域具有非常广阔的应用前景。
【附图说明】
[0021] 图1是厮带来源间充质干细胞的原代细胞。
[0022] 图2是第二代厮带来源间充质干细胞。
[0023] 图3是厮带来源间充质干细胞的细胞表面标记的检测结果。
[0024] 图4是厮带来源间充质干细胞的细胞的增殖曲线。
[0025] 图5是厮带来源间充质干细胞向成脂方向分化的染色鉴定。
[0026] 图6是厮带来源间充质干细胞向成骨方向分化的染色鉴定。
[0027] 图7是动物模型中，四组小鼠在第Η天的空腹血糖的检测结果。
[002引图8是动物模型中，四组小鼠的血糖水平监测结果。
[002引图9是动物模型中，四组小鼠的膜岛素水平监测结果。
【具体实施方式】 [0030] 实施例1
[0031] 厮带来源的间充质干细胞制剂的制备
[0032] 在超净工作台中操作，将新鲜获取的厮带用己醇进行消毒，再用生理盐水清洗厮 带，分离剥除厮带血管，获得华通氏胶部分，将华通氏胶剪碎，稀释后种瓶，在二氧化碳培 养箱中采用组织贴壁法培养，显微镜下观察细胞生长情况，可W看到细胞贴壁生长，呈长梭 形，包浆透亮，胞体较小，有立体感，通过全量换液逐渐去除未贴壁细胞，待细胞融合度达到 70-80%即可收获原代细胞，结果见图1 ;将所得原代细胞在DMEM培养基中进行传代培养， W达到纯化和扩增培养间充质干细胞的目的，结果见图2 ;收集第3~8代间充质干细胞， 制成干细胞制剂，低温冻存。
[003引 实施例2
[0034] 厮带来源的间充质干细胞的表面标记研究
[0035] 利用流式细胞仪检测细胞表面标记，结果见图3。同MSCs相关的细胞表面标记 CD73、CD90、CD105呈高表达，各个代次的表达都稳定，均高于95% ;同造血细胞相关的细胞 表面标记CD14、CD34、CD45、CD19 W及同免疫排斥相关的HLA-DR表达低，均低于3%。证明 多次传代后厮带来源的MSCs含有能稳定增殖的干细胞，细胞高表达MSCs相关的标记，不表 达或低表达造血细胞和与移植排斥相关的细胞表面标记，提示此类MSCs细胞是一类低免 疫原性的干细胞，可能在抗自体免疫疾病，治疗移植后排斥方面起到作用。
[003引 实施例3
[0037] 厮带来源的间充质干细胞的增殖研究
[0038] 将传代细胞种植于96孔板中，分12组，每组7孔，每孔加入细胞悬液200 μ 1。随 机取传代培养细胞，根据Μ?Τ