一种用于治疗糖尿病的干细胞制剂及其制备方法
【专利摘要】本发明提供一种用于治疗糖尿病的干细胞制剂，包含：a.从人体血液或组织器官中分离提取的干细胞和/或由所述干细胞诱导分化而来的胰岛样细胞，细胞含量为1×105-5×107个/ml；及b.含0.5％肝素钙的细胞保存液。本发明还提供这种干细胞制剂的制备方法，包括以下步骤：（1）干细胞的分离纯化；（2）干细胞体外培养，或干细胞体外诱导分化成胰岛样细胞；（3）将步骤（2）获得的细胞用保存液稀释，制成干细胞制剂；（4）干细胞制剂的质量检测。该干细胞制剂移植到体内可以分化为胰岛素分泌细胞，分泌胰岛素，有效降低糖尿病人血糖浓度，从而为克服糖尿病依赖胰岛素治疗、根治糖尿病提供了新的途径。
【专利说明】—种用于治疗糖尿病的干细胞制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及干细胞研究领域，尤其涉及用于治疗糖尿病的干细胞制剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002]糖尿病是由于胰岛素分泌不足或胰岛素功能障碍引起的一类代谢疾病，主要包括I型和II型糖尿病。近年来，糖尿病发病率呈上升趋势，而且更趋年轻化。预计截止到2025年，世界范围内将有3.34亿人次患有糖尿病，糖尿病已成为威胁人类健康的一大顽疾。
[0003]目前治疗糖尿病的方法主要为传统的治疗方法，有注射胰岛素、口服降糖药、控制饮食、适度运动等。临床上一般采用注射胰岛素来维持血糖，但胰岛素注射既不能精确调节体内血糖水平，也不能阻止糖尿病并发症的发生，而且往往最终会造成患者的胰岛素依赖。目前并无更有效的治疗糖尿病的方法，因此各国学者在不断地探索并寻找出更好的治疗方案，提高糖尿病患者的治疗效果或控制糖尿病患者的胰岛素使用量。例如，采用细胞渗透修复疗法替代异常β细胞工作，使自体β细胞得以修养恢复；用β细胞重组激活技术修复功能受损、衰竭的胰岛β细胞；对晚期糖尿病患者采用胰岛移植手术疗法，等等。胰岛移植手术疗法虽然可以避免胰岛素注射引起的低血糖或胰岛素抵抗，但是受到胰腺供体严重缺乏的限制，并且因手术并发症和免疫排斥反应等而使移植的远期效果不理想。
[0004]近年来，干细胞可塑性研究为各种疾病的治疗提供了一种新的手段。干细胞是一种具有巨大增殖潜能的细胞，可分化为多种细胞类型，因而为组织器官的再造移植和重大疾病的治疗提供了希望。目前研究表明人体干细胞可以分化成多种细胞类型包括胰岛细胞、血管内皮细胞、心肌细胞等。干细胞移植治疗对许多慢性疾病和退化性疾病有很好的治疗前景。移植到体内的干细胞可以分化为多种组织细胞从而重建损伤组织和器官。已有研究表明干细胞能在体内体外转化成胰岛细胞，在临床上具有治疗糖尿病的可能(王爱红等，人脐带间充质干细胞向胰岛样细胞的分化，中国组织工程研究与临床康复，200812(21):4102-4106)。然而，尚未见关于治疗糖尿病的干细胞制剂开发成功的报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种用于治疗糖尿病的干细胞制剂及其制备方法，其具有稳定性高、疗效好、安全性高、适用于临床大规模使用、应用前景广阔的特点，能够克服上述糖尿病治疗方法的缺点，为临床上干细胞的使用提供新的途径。
[0006]本发明提供的用于治疗糖尿病的干细胞制剂，包含:
[0007]a.从人体血液或组织器官中分离提取的干细胞和/或由所述干细胞诱导分化而来的胰岛样细胞，细胞含量为I X 105-5 X IO7个/ml ;及
[0008]b.含0.5%肝素钙的细胞保存液。
[0009]上述人体血液或组织器官包括但不限于人体的脐带、脐带血、月经血、骨髓、牙齿、脂肪组织、胰腺和肝脏。[0010]本发明提供的用于治疗糖尿病的干细胞制剂，其中的主要活性成分可以是:
[0011]从人体血液或组织器官中分离提取的干细胞；或
[0012]由干细胞诱导分化而来的胰岛样细胞；或
[0013]上述两种细胞组成的混合物。
[0014]所述干细胞和/或由所述干细胞诱导分化而来的胰岛样细胞保存于可以保持细胞活性的溶剂与0.5%的肝素钙组成的保存液中。
[0015]本发明提供的用于治疗糖尿病的干细胞制剂中的干细胞可以是在分离提取后进一步经体外培养的干细胞。
[0016]所述的干细胞来源于人体的脐带、脐带血、月经血、骨髓、牙齿、脂肪组织、胰腺、肝脏及其他可以提取干细胞的组织或器官等。
[0017]所述的干细胞呈纤维样贴壁生长，该细胞群表达⑶44、⑶90、⑶29、⑶73，不表达或低表达 CD34、CD45、HLA-DR0
[0018]本发明干细胞制剂中的保存液由可以保持细胞活性的溶剂配制而成，所述溶剂包括但不限于生理盐水或无菌PBS溶液。
[0019]所述制剂中含有I X ΙΟ5—5X107个/ml干细胞或胰岛样细胞。
[0020]本发明还提供了一种用于治疗糖尿病的干细胞制剂的制备方法，包括以下步骤:
[0021](I)干细胞的分离纯化；
[0022](2)干细胞体外培养，或干细胞体外诱导分化成胰岛样细胞；
[0023](3)将步骤(2)获得的细胞用保存液稀释，制成干细胞制剂；
[0024](4)干细胞制剂的质量检测。
[0025]所述的干细胞的分离纯化包括以下步骤:将检测合格的人体组织或器官经过机械剪碎后，经过胶原酶消化为单细胞悬液后，加入含有胎牛血清的a -MEM培养基或DMEM培养基终止消化，再将所有液体移入离心管中1500rpm离心5min，弃去上清，加入培养基重悬，将细胞悬液接种在含有胎牛血清的a -MEM培养基或DMEM培养基的培养瓶或培养板中，待成纤维状细胞达到60-80%融合时，进行胰酶消化、传代、再培养，以达到纯化和扩增干细胞的目的。
[0026]所述的干细胞体外诱导分化成胰岛样细胞包括以下步骤:取人干细胞经复苏后，按I X IO6个细胞加入1-3ml诱导培养基(a -MEM培养基或DMEM培养基，内含15%_20%血清替代品、1%非必需氨基酸、lmmol/L谷氨酰胺、4-6 μ g/L重组人碱性纤维母细胞生长因子、5-1OmmoI/L尼克酰胺);置于培养箱中培养；每2_3天更换培养基，培养时间2_3周，以2周左右为宜。收获胰岛样细胞备用。
[0027]所述的体外培养干细胞的装置包括孔板、平板、T瓶、反应器、细胞工厂等。
[0028]本发明的用于治疗糖尿病的干细胞制剂可通过静脉、腹腔或原位注入患者体内，以有效发挥治疗糖尿病的作用。例如，对于人脂肪干细胞制剂/人脂肪干细胞衍生的胰岛样细胞制剂，可将质量检测合格的I X IO6个细胞/ml (含0.5%肝素钙的生理盐水混悬液)，以0.5 X IO6-1X IO6个细胞/公斤体重静脉注入。
[0029]本发明与现 有技术相比，具有以下优点:
[0030]本发明打破了糖尿病的传统治疗方法，巧妙地运用人来源干细胞及其衍生而来的胰岛样细胞，并将其与其他成分组合制备成干细胞制剂，其稳定性高，疗效好，用后无任何毒副作用，为临床大规模使用奠定了基础。
[0031]本发明提供的用于治疗糖尿病的干细胞制剂移植到人体后可分化成胰岛素分泌细胞，能够有效降低病人血糖浓度，避免胰岛素注射引起的低血糖或胰岛素抵抗，更重要的是能减少和改善糖尿病并发症。并且能够解决胰岛移植治疗糖尿病目前受到胰腺供体严重缺乏的限制，且能够避免出现免疫排斥等问题。
[0032]而且，本发明制剂中的干细胞由于来源广泛，不受伦理限制、免疫原性低使其成为糖尿病治疗的新的有效手段，应用前景十分广阔。
[0033]附图的简要说明
[0034]图1显示脂肪干细胞(ADSCs)分离过程中原代培养24小时的贴壁细胞。
[0035]图2显示原代培养5天时形成的脂肪干细胞集落。
[0036]图3显示培养3代细胞形态趋于一致的脂肪干细胞。
[0037]图4显示流式细胞仪检测培养至第5代生长良好的细胞表面抗原分子的测定结
果O
[0038]图5显示第5 代ADSCs诱导胰岛分化12天后形成的类似圆形或不规则形的细胞簇。
[0039]图6显示诱导15天的胰岛样细胞团双硫腙工作液染色后的结果。
[0040]图7显示干细胞制剂对糖尿病模型大鼠血糖水平的影响。
[0041]图8显示干细胞制剂对糖尿病模型大鼠体重的影响。
[0042]图9显示干细胞制剂移植后糖尿病模型大鼠组织学检测结果。
【具体实施方式】
[0043]为更进一步阐述本发明为达成预定目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实施例，对依据本发明提出的用于治疗糖尿病的干细胞制剂及其制备方法进行说明。
[0044]实施例1:人脂肪间充质干细胞制剂的制备
[0045]将检测合格的脂肪经过机械剪碎后，经过胶原酶消化为单细胞悬液后，加入含有胎牛血清的a -MEM培养基或DMEM培养基终止消化，再将所有液体移入离心管中1500rpm离心5min，弃去上清，加入培养基重悬，调整细胞密度为I X IO6个/ml，将细胞悬液按3ml/每板接种在含有胎牛血清的a -MEM培养基或DMEM培养基的培养板中，待成纤维状细胞达到60-80%融合时，进行胰酶消化、传代、再培养，以达到纯化和扩增培养脂肪间充质干细胞的目的，收集第3-8代细胞严格按照低温保存步骤冻存、复苏备用。
[0046]实施例2:人脂肪干细胞衍生的胰岛样细胞制剂的制备
[0047]将检测合格的脂肪经过机械剪碎后，经过胶原酶消化为单细胞悬液后，加入含有胎牛血清的a -MEM培养基或DMEM培养基终止消化，再将所有液体移入离心管中1500rpm离心5min，弃去上清，加入培养基重悬，调整细胞密度为I X IO6个/ml，将细胞悬液按3ml/每板接种在含有胎牛血清的a -MEM培养基或DMEM培养基的培养板中，待成纤维状细胞达到60-80%融合时，进行消化、传代、再培养，以达到纯化和扩增培养脂肪间充质干细胞的目的，收集第3-8代细胞严格按照低温保存步骤冻存、复苏备用。
[0048]取复苏的人脂肪干细胞加入诱导培养基后置于培养箱中培养；每IXlO6个细胞中加入l_3ml诱导培养基，所述的诱导培养基为a-MEM培养基或DMEM培养基，内含15%-20%Knock0ut?血清替代品、1%非必需氨基酸、lmmol/L谷氨酰胺、4_6ng/ml重组人碱性纤维母细胞生长因子、5-lOmmol/L尼克酰胺。每2_3天换培养液，培养2周左右，收获胰岛样细胞。
[0049]实施例3:对N0D/SCID大鼠移植脂肪来源干细胞制剂的实验
[0050]I)脂肪来源干细胞制剂的制备
[0051]a.按照实施例1的方法制备脂肪来源人脂肪间充质干细胞制剂:
[0052]将检测合格的脂肪经过机械剪碎后，经过胶原酶消化为单细胞悬液后，加入含有胎牛血清的a -MEM培养基或DMEM培养基终止消化，再将所有液体移入离心管中1500rpm离心5min，弃去上清，加入培养基重悬，调整细胞密度为I X IO6个/ml，将细胞悬液按3ml/每板接种在含有胎牛血清的a -MEM培养基或DMEM培养基的培养板中，待成纤维状细胞达到60-80%融合时，进行胰酶消化、传代、再培养，以达到纯化和扩增培养脂肪间充质干细胞的目的，收集第3-8代细胞严格按照低温保存步骤冻存、复苏备用。
[0053]b.按照实施例2的方法制备人脂肪干细胞体外诱导胰岛样细胞团:
[0054]将分离提取的第3-8代脂肪干细胞置于含10%新生牛血清的DMEM培养液中扩增培养三、四天，达70%-80%融合后，换用含15%-20%血清替代品、1%非必需氨基酸、lmmol/L谷氨酰胺、4-6ng/ml重组人碱性纤维母细胞生长因子、5-10mmol/L尼克酰胺的a -MEM培养基或DMEM培养基，每2-3天换培养液，培养2周左右，收获胰岛样细胞。
[0055]诱导分化的胰岛样细胞团鉴定:使用双硫腙染色法检测胰岛样细胞团。双硫腙IOmg溶于Iml 二甲基亚砜中配成储备液，一 20°C保存备用。使用时用磷酸盐缓冲液1:100稀释，0.22 μ m孔径滤膜过滤，即为工作液。在倒置显微镜下随机挑取诱导获得的胰岛样细胞团加入工作液37°C孵育15min后，磷酸盐缓冲液洗3次，镜检。
[0056]2)大鼠糖尿病模型的建立:采用完全随机法，将36只N0D/SCID大鼠分为链脲菌素注射组30只，正常对照组6只。用0.lmol/L柠檬酸一梓檬酸钠缓冲液(pH 4.4)将链脲菌素配制成2%注射液。空腹12h后链脲菌素注射组腹腔注射70mg/kg体重的链脲菌素，正常对照组腹腔注射70mg/kg体重的柠檬酸一梓檬酸钠缓冲液(pH 4.4)。大鼠分别于注射前和注射后48h、第5天和第8天空腹断尾采血，用血糖仪测定全血血糖浓度，选取连续2次血糖浓度高于16.7mmol/L的大鼠作为糖尿病模型。
[0057]3)大鼠糖尿病的干细胞制剂移植实验治疗:采用完全随机法将已成模的糖尿病大鼠分为3组:胰岛样细胞移植组9只，进行肾被膜下胰岛样细胞团移植，每只大鼠植入胰岛样细胞团数目3000±100个；干细胞移植组9只，肾被膜下移植未进行诱导的脂肪干细胞细胞数约2X106个；糖尿病对照组6只，肾被膜下移植不含细胞的培养液。3组大鼠均于移植前及移植后48h测定空腹血糖浓度，之后每周定点测空腹血糖及称体重I次。
[0058]4)实验效果主要观察指标:①人脂肪干细胞诱导分化胰岛样细胞团及其鉴定结果糖尿病大鼠移植效果的观察糖尿病大鼠移植后的组织学检测。统计学分析采用SPSS 10.0统计软件进行统计分析。所有数据均采用均值土标准误表示，组间比较采用t检验。
[0059]试验结果为:
[0060]I)分离的脂肪干细胞接种24h后，几乎所有细胞都贴附于培养瓶底，轻晃培养瓶可见大部分细胞随培养液晃动，全量换液时可见贴壁细胞，贴壁细胞有小的突起(可参见图1)。3天后细胞开始增殖，并出现多种形态的细胞，细胞逐渐形成分散的集落，多为成纤维细胞样和宽大扁平的细胞(可见图2)，7~8天时，集落内细胞汇合，细胞分裂相减少，随培养时间延长，至14天左右，细胞生长达80%-90%融合，其形态呈比较均一的长梭形，呈放射状或旋涡状排列(可参见图3)。
[0061]2)流式细胞仪检测:取培养第5代生长良好的细胞，流式细胞仪检测脂肪干细胞的表面抗原特性。测定结果显示(可参见图4) =ADSCs均一的表达⑶44，⑶90阳性，阳性细胞百分率分别为95.23%,93.00%;⑶34(造血干细胞的表面特异性标记)、⑶45 (白细胞表面共同抗原)表达阴性，仅有微弱表达，细胞表达的百分率分别为7.30%,8.21%。结果表明分离培养得到的ADSCs是具有均一细胞表面特征的细胞群，这是一群区别于造血干细胞(hematopoietie stemcells, HSCs)并处于未分化状态的干细胞。
[0062]3)脂肪干细胞进体外诱导后，从第4天胰岛样细胞团开始出现，此后胰岛样细胞团逐渐增大、数量增多，光镜下可看到细胞团周边突触逐渐缩短，中心渐变圆，多数细胞已聚集成簇，结构类似胰岛(可参见图5)。经过双硫腙染色观察，诱导15天的胰岛样细胞团双硫腙工作液染色15分钟后，可见细胞团内多数细胞染成猩红色。这表明诱导出来的细胞团是分化成胰岛样细胞的脂肪干细胞(可参见图6)。
[0063]4)糖尿病大鼠移植效果的观察
[0064]①血糖浓度变化
[0065]将24只已成模的糖尿病模型大鼠随机分为3组:胰岛样细胞移植组；干细胞移植组和对照组(3组大鼠空腹血糖 浓度均在糖尿病血糖浓度范围内)。胰岛样细胞移植组大鼠移植后2周内，血糖浓度均有所降低，但仍高于正常血糖浓度范围，移植后第3周血糖浓度迅速上升之后一直维持高血糖状态。干细胞移植组大鼠移植后血糖一直处于较高水平，移植后第6周血糖开始下降，之后维持于较低水平。与两移植组大鼠相比，糖尿病对照组大鼠血糖浓度一直处于糖尿病血糖浓度范围内，无一只下降(可参见图7 )。
[0066]②体重变化
[0067]随实验时间延长，糖尿病对照组大鼠体重明显降低，表现出糖尿病典型症状“消瘦”，而两移植组大鼠体重虽然降低但降低的幅度小于糖尿病对照组大鼠，统计学差异不显著(Ρ>0.05)(可参见图8)。
[0068]③组织学检测结果
[0069]胰岛素免疫荧光组织化学染色结果表明，在未接受细胞移植的糖尿病大鼠的胰腺内(图9a)，未发现胰岛素阳性的细胞；在脂肪干细胞和胰岛样细胞团移植后的胰腺内胰岛素染色可显示移植细胞。ADSCs分化的胰岛样细胞移植2周后(图9b)，移植部位粘膜下层出现大量胰岛素阳性染色的移植细胞，有小部分迁移到粘膜层；移植后4周(图9c)，在移植部位的粘膜下层可见散在的成簇的胰岛素阳性着色的移植细胞，细胞簇开始逐渐，这些细胞簇在形态结构上类似胰岛；移植后8周(图9d)，仍可见成簇的胰岛素阳性的移植细胞。
[0070]上述动物实验证明:体内移植本发明的干细胞制剂后，干细胞可以快速到达损伤的胰腺组织参与组织修复。本实验中移植胰岛样细胞团的大鼠在移植后2周内血糖均有所下降，表明植入的细胞在短时间内发挥了作用，分泌胰岛素使大鼠血糖下降；但血糖浓度仍高于正常水平，说明进入胰腺的诱导的胰岛样细胞尚未完全成熟，分泌的胰岛素量不足以维持正常水平。移植干细胞制剂的大鼠在移植后第6周血糖开始下降，之后维持于较低水平，提示干细胞制剂中的脂肪干细胞或诱导的胰岛样细胞在体内经历了向胰岛β细胞分化的过程，能够分泌足量的胰岛素保持体内血糖稳定。同时移植干细胞制剂的大鼠体重减少小于对照组糖尿病大鼠，表明本发明所制备的干细胞制剂在糖尿病治疗中的主要生理指标(血糖水平、体重变化)都有明显治疗效果，可以减轻糖尿病病症(见表1、表2 )。
[0071]表1干细胞制剂移植治疗糖尿病模型大鼠的血糖水平情况0- οι mol/L)
【权利要求】
1.一种用于治疗糖尿病的干细胞制剂，包含: a.从人体血液或组织器官中分离提取的干细胞和/或由所述干细胞诱导分化而来的胰岛样细胞，细胞含量为I X 105-5 X IO7个/ml ;及 b.含0.5%肝素钙的细胞保存液。
2.如权利要求1所述的干细胞制剂，其中所述人体血液或组织器官选自人体的脐带、脐带血、月经血、骨髓、牙齿、脂肪组织、胰腺和肝脏。
3.如权利要求1所述的干细胞制剂，其中所述干细胞是在分离提取后进一步经体外培养的干细胞。
4.如权利要求1所述的干细胞制剂，其中所述干细胞呈纤维样贴壁生长，该细胞群表达 CD44、CD90、CD29、CD73，不表达或低表达 CD34、CD45、HLA-DR0
5.如权利要求1所述的干细胞制剂，其中所述细胞保存液由生理盐水或无菌PBS溶液配制而成。
6.一种如权利要求1所述用于治疗糖尿病的干细胞制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)干细胞的分离纯化； (2)干细胞体外培养，或干细胞体外诱导分化成胰岛样细胞； (3)将步骤(2)获得的细胞用保存液稀释，制成干细胞制剂； (4)干细胞制剂的质量检测。
7.如权利要求6所述的制备方法，其中所述干细胞的分离纯化和体外培养包括以下步骤:将检测合格的人体血液或剪碎的组织器官用胶原酶消化为单细胞悬液，加入含有胎牛血清的a -MEM培养基或DMEM培养基终止消化，离心分离除去上清，加培养基重悬，将细胞悬液接种在含有胎牛血清的a -MEM培养基或DMEM培养基的培养瓶或培养板中，待成纤维状细胞达到60-80%融合时，进行胰酶消化、传代、再培养。
8.如权利要求6所述的制备方法，其中所述干细胞体外诱导分化成胰岛样细胞包括以下步骤:取人干细胞经复苏后，按I X IO6个细胞加入l_3ml诱导培养基:a -MEM培养基或DMEM培养基，内含15%-20%血清替代品、1%非必需氨基酸、lmmol/L谷氨酰胺、4_6 μ g/L重组人碱性纤维母细胞生长因子、5-lOmmol/L尼克酰胺；置于培养箱中培养；每2_3天更换培养基，培养时间2-3周。
9.如权利要求6所述的制备方法，其中所述干细胞制剂的质量检测包括细菌、真菌、支原体、病毒、内毒素、热源检测及细胞活性检测。
【文档编号】C12N5/071GK103845362SQ201210517298
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2012年12月5日 优先权日:2012年12月5日
【发明者】刘勇, 陈彦田, 齐瀚实 申请人:上海坤爱生物科技有限公司