一种泰乐菌素产生菌、遗传改造方法及其应用的制作方法

一种泰乐菌素产生菌、遗传改造方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种泰乐菌素产生菌、遗传改造方法及其应用。通过对泰乐菌素生物合成基因簇中碳霉糖合成基因簇(包含tylCVII、tylCV、tylCIII、tylCIV及tylCII)的同框敲除，获得可以直接生产替米考星的合成前体—泰乐菌素B(Tb)的菌株。本发明的泰乐菌素产生菌可直接发酵生产替米考星的合成前体，简化替米考星的合成工艺。
【专利说明】一种泰乐菌素产生菌、遗传改造方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体地，本发明涉及一种泰乐菌素产生菌、遗传改造方法及其应用，本发明还涉及一种直接发酵生产替米考星合成前体泰乐菌素B的方法。
【背景技术】
[0002]禽类呼吸道感染诱发的疾病是当今危害畜牧业发展的主要原因之一，目前用于防治此类疾病的有效药物很少，主要是采用大环内酯类药物泰乐菌素。泰乐菌素(Tylosin)，又名泰乐星、泰洛霉素，是一类十六元环大环内酯类抗生素。美国礼来公司于1962年开发并成功推向市场，迄今为止已工业化生产40多年，是一类极其重要的禽畜专用抗生素，它广泛用作饲料添加剂和动物治疗，能明显促进禽畜生长，并提高饲料的利用率。
[0003]泰乐菌素的作用原理是，它通过与核糖体50S亚基结合从而选择性地阻断原核生物蛋白质的合成，是一类广谱低毒的抗生素。由于存在耐药性的问题，以及近年来发现其在禽畜体内有药物残留，再加之其与红霉素等人用大环内酯类抗生素的结构具有很大的相似性，欧盟委员会1999年正式作出决议，禁止将泰乐菌素作为“动物生长促进剂”用作饲料添加剂。
[0004]20世纪80年代,英国Elanco动物保健品公司开发了以泰乐菌素为前体半合成的大环内酯类禽畜用抗生素-替米考星(Tilmicosin)，替米考星抗菌作用与泰乐菌素相似，主要抗革兰氏阳性菌和支原体，对少数革兰氏阴性菌也有效，然而其对胸膜肺炎放线杆菌、畜禽支原体和巴氏杆菌的活性比泰乐菌素强。与泰乐菌素相比，替米考星具有与其类似的分子结构和更优化、更广的抗菌谱，并且与临床常用的其它抗生素之间无交叉抗药性，因此具有较高的实际应用价值。替米考星已被美国FDA批准临床使用于治疗牛、山羊、绵羊、奶牛、猪、鸡等动物由敏感菌引起的传染性疾病，特别是禽畜的呼吸道感染疾病。
[0005]目前替米考星的传统生产是将泰乐菌素产生菌进行发酵，发酵产物中的泰乐菌素包括泰乐菌素A (Ta)和泰乐菌素B (Tb)。通过水解泰乐菌素A (Ta)，获得泰乐菌素B (Tb)(见图1)，然后泰乐菌素B通过胺化作用连接上一个3’ 5’ - 二甲基哌啶基，从而形成终产物替米考星。采用敲除碳霉糖糖基转移酶tylCV的方法获得了以泰乐菌素B产量上升的工程菌株，然而仍有一定量的泰乐菌素A产生，并且由于从发酵产物中提取泰乐菌素B的流程十分繁琐，产物得率很低，因此在很大程度上限制了泰乐菌素B的应用。
[0006]因此本领域迫切需要对泰乐菌素生产菌进行改造，开发适用于大规模工业生产的泰乐菌素B的工艺方法。

【发明内容】

[0007] 本发明的目的是提供一种泰乐菌素产生菌及其应用。
[0008]本发明的另一目的是提供一种新型泰乐菌素产生菌的遗传改造方法及其用途。
[0009]在本发明的第一方面，提供了一种泰乐菌素产生菌，所述的产生菌的发酵产物中，泰乐菌素B (Tb)的相对含量满足下式:[0010]B/ (A+B) ^ 95%
[0011]式中，
[0012]B为发酵产物中泰乐菌素B(Tb)的质量；
[0013]A为发酵产物中泰乐菌素A(Ta)的质量。
[0014]在另一优选例中，泰乐菌素B (Tb)的相对含量≥96%,更佳地≥99%,最佳地≥ 99.5%。
[0015]在另一优选例中，所述泰乐菌素产生菌为链霉菌属。
[0016]在另一优选例中，所述泰乐菌素产生菌为弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)SWL00020，保藏编号为:CGMCC N0.6717。
[0017]在另一优选例中，所述产生菌的基因组中碳霉糖合成基因簇被失活或敲除。
[0018]在另一优选例中，所述产生菌中缺失以下5种基因:tylCVI1、tylCV、tylCII1、tylCIV 和 tylCII。
[0019]在另一优选例中，所述产生菌不表达以下5种基因:tylCVI1、tylCV、tylCII1、tylCIV 及 tylCII。
[0020]在另一优选例中，所述基因簇的序列如SEQ ID N0:1所示。
[0021]在本发明的第二方面，提供了一种第一方面所述的泰乐菌素产生菌的用途，它被用做发酵生产泰乐菌素B (Tb)的工程菌株。
[0022]在本发明的第三方面，提供了一种生产泰乐菌素B(Tb)的方法，包括步骤:
[0023](a)培养第一方面所述的泰乐菌素产生菌，从而产生含有泰乐菌素B的发酵产物；和
[0024](b)从发酵产物中分离出泰乐菌素B(Tb)。
[0025]在本发明的第四方面，提供了一种生产替米考星的方法，
[0026](a)培养第一方面所述的泰乐菌素产生菌，从而产生含有泰乐菌素B的发酵产物；
[0027](b)从发酵产物中分离出泰乐菌素B(Tb);和
[0028](c)将分离出的泰乐菌素B(Tb)转化为替米考星。
[0029]在另一优选例中，步骤(C)所述转化是将泰乐菌素B (Tb)与3’5’一二甲基哌啶基进行胺化作用，形成替米考星。
[0030]在本发明的第五方面，提供了一种制备泰乐菌素产生菌的方法，包括步骤:
[0031](I)构建用于同源重组的载体，所述的载体依次含有以下元件:碳霉糖合成基因簇上游同源臂序列，连接序列，和碳霉糖合成基因簇下游的同源臂序列；
[0032](2)将步骤(1)的所述载体导入出发菌株，获得导入载体的菌株，其中所述的出发菌株可发酵产生泰乐菌素A和泰乐菌素B ；
[0033](3)从步骤(2)获得的导入载体的菌株中，筛选所述上游同源臂序列和下游同源臂序列与出发菌株的基因组发生了二次同源重组的菌株，从而获得泰乐菌素产生菌。
[0034]在另一优选例中，步骤(3)之后还包括步骤(4):验证泰乐菌素产生菌是否缺失碳酶糖合成基因簇。
[0035]在另一优选例中，步骤(1)所述的连接序列为0_200bp长度碱基序列。
[0036]在另一优选例中，步骤(1)所述同源臂序列是用PCR扩增的方法获得的。
[0037]在另一优选例中，步骤⑴所述同源臂序列的长度没有特别限制，较佳地≥ 15000bp。
[0038]在另一优选例中，步骤(1)所述载体为穿梭质粒，较佳地为大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒。
[0039]在另一优选例中，步骤(1)所述载体还含有抗生素抗性基因，较佳地为阿泊拉霉素抗性基因。
[0040]在另一优选例中，步骤(2)所述的导入方法为接合转移导入法。
[0041]在另一优选例中，步骤(2)所述的出发菌株为链霉菌属，较佳地为弗氏链霉菌，更佳地为弗氏链霉菌NRRL2702。
[0042]在另一优选例中，步骤(3)所述的基因组与载体发生二次同源重组的菌株为失去阿泊拉抗性的二次同源重组的菌株。
[0043]在另一优选例中，所述碳霉糖合成基因簇包含基因tylCVI1、tylCV、tylCII1、tylCIV 及 tylCI。
[0044]在另一优选例中，所述碳霉糖合成基因族的序列如SEQ ID N0:1所不。
[0045]在本发明的第六方面，提供了一种用于同源重组的载体，所述载体依次含有以下元件:碳霉糖合成基因簇上游同源臂序列，连接序列，和碳霉糖合成基因簇下游的同源臂序列，且所述载体缺失碳霉糖合成基因簇。
[0046]在另一优选例中，所述碳霉糖合成基因簇包含基因tylCVI1、tylCV、tylCII1、tylCIV 及 tylCI。
[0047]在另一优选例中，所述碳霉糖合成基因族的序列如SEQ ID N0:1所不。
[0048]在另一优选例中，所述的连接序列为0_200bp长度的碱基序列。
[0049]在本发明的第七方面，提供了一种宿主细胞，所述细胞含有第六方面所述的载体或染色体整合有碳霉糖合成基因簇上游和下游同源臂序列和3’同源臂序列，且缺失90%以上的碳霉糖合成基因簇。
[0050]在另一优选例中，所述宿主细胞为大肠杆菌或链霉菌，较佳地大肠杆菌为E.coliDH5a和E.coli ET12567，链霉菌为弗氏链霉菌NRRL2702。
[0051]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
【专利附图】

【附图说明】
[0052]下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
[0053]图1显示了泰乐菌素的化学结构，方框部分为碳霉糖结构，即通过遗传改造去掉的碳霉糖结构。
[0054]图2显示了泰乐菌素的生物合成基因簇，方框部分为碳霉糖生物合成基因簇，即本发明所述同框敲除方法敲除的基因簇。
[0055]图3显示了不同菌株发酵产物HPLC分析结果；图3A为出发菌株发酵产物HPLC分析结果，以泰乐菌素A (Ta)为主要成分；图3B为只同框敲除糖基转移酶tylCV的突变株发酵产物HPLC分析结果，以泰乐菌素B (Tb)为主，仍产生少量泰乐菌素A ;图3C为突变株mLffllOl发酵产物HPLC分析结果，以泰乐菌素B (Tb)为主要成分,不产生泰乐菌素A。
[0056]图4显示了不同菌株发酵产物LC-MS分析结果；图4A为出发菌株发酵产物LC-MS分析结果，以泰乐菌素A (Ta)为主；图4B为突变株mLWllOl发酵产物LC-MS分析结果，以泰乐菌素B (Tb)为主。
【具体实施方式】
[0057]本发明人经过广泛而深入的研究，对泰乐菌素生物合成基因簇中的碳霉糖合成基因簇进行失活，意外地发现，突变体发酵产物中泰乐菌素B的含量得到大大提高，且几乎不再产生泰乐菌素A。将产物泰乐菌素B作为前体，可以直接用于替米考星的合成。
[0058]具体地,对碳霉糖合成基因簇tylCVI1、tylCV、tylCII1、tylCIV及tylCII进行敲除，获得的产物90wt%以上为泰乐菌素B。
[0059]用本发明方法对菌株进行遗传改造，重现性好，经改造的泰乐菌素产生菌遗传稳定，不易突变，极大简化了替米考星的生产工艺，提高了生产效率，生产过程安全无污染，显著降低了替米考星的生产成本。在此基础上完成了本发明。
[0060]术语
[0061]如本文所用，术语“以上”和“以下”包括本数，例如“90%以上“指≤90%, "0.2%以下”指≤0.2%。
[0062]术语“不含/不产生泰乐菌素A”或“基本上不含/不产生泰乐菌素A”可互换使用，指发酵产物中泰乐菌素A组分的含量≤0.lwt%，较佳地≤0.01wt%,更佳地≤0.005wt%(如Owt%)ο
[0063]菌株
[0064]如本文所用，术语“本发明出发菌株”或“本发明出发微生物”指的是弗氏链霉菌Streptomyces fradiae NRRL2702。本发明的出发菌株来自于美国农业部军中保藏中心,编号为NRRL 2702。应理解，出发菌株不仅包括弗氏链霉菌Str印tomyces fradiae NRRL2702的菌株，还包括其衍生菌株及其他产泰乐菌素的菌株。
[0065]菌种保藏
[0066]本发明的弗氏链霉菌(Str印tomyces fradiae) SWL00020，于2012年10月29日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC N0.6717。
[0067]碳霉糖合成基因簇
[0068]如图2，碳霉糖合成基因簇序列如SEQ ID NO:1所示，包括5个基因:分别为tylCVII (3，5-异构酶)、丨71(^ (碳霉糖糖基转移酶)、tylCIII (3-C-甲基转移酶)、tylCIV(4-酮基还原酶)、tylCII (2，3-烯酰还原酶)。泰乐菌素生物合成中负责碳霉糖的生物合成。
[0069]引物
[0070]如本文所用，术语“引物”指的是在与模板配对，在DNA聚合酶的作用下能以其为起点进行合成与模板互补的DNA链的寡居核苷酸的总称。引物可以是天然的RNA、DNA,也可以是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。
[0071]引物“大致上”(或“基本上”)与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必须与模板上的一条链充分互补才能开始延伸，但引物的序列不必与模板的序列完全互补。t匕如，在一个3’端与模板互补的引物的5’端加上一段与模板不互补的序列，这样的引物仍大致上与模板互补。只要有足够长的引物能与模板充分的结合，非完全互补的引物也可以与模板形成引物-模板复合物，从而进行扩增。
[0072]构建重组质粒
[0073]根据本文所述的基因簇及其外部两端的核苷酸序列，本【技术领域】人员可方便地用各种已知方法制得本发明的同源重组序列。这些方法例如但不限于:PCR，DNA人工合成等，具体的方法可参见J.萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》。
[0074]所述的“操作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。
[0075]本发明还提供了一种穿梭质粒载体。在本发明的一个优选例中，穿梭质粒载体可以为pKC1139质粒。根据已知载体的酶切图谱，本领域技术人员可按照常规方法通过限制性酶剪切与拼接，将本发明的序列插入合适的限制性位点，制得本发明的重组载体。
[0076]转化
[0077]将含有所述编码序列的载体导入宿主细胞，可采用本领域的多种已知技术，包括但不限于:磷酸钙沉淀，原生质体融合，脂质体转染，电穿孔，微注射，反转录法，噬菌体转导法，碱金属离子法。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法:磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
[0078]获得的转化子可 以用常规方法培养，复制本发明的基因序列。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
[0079]本发明还提供了一种宿主细胞，其中含有本发明的编码序列。所述的宿主细胞优选的是原核细胞，一个适用于本发明的宿主细胞为宿主甲基化修饰缺失的大肠杆菌E.coliET12567。
[0080]同源重组
[0081]同源重组(Homologus Recombination)是指发生在姐妹染色单体(non-sisterchromatin)之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。同源重组需要一系列的蛋白质催化，如原核生物细胞内的RecA、RecB⑶、RecF,RecO, RecR等；以及真核生物细胞内的Rad51、Mrell-Rad50等。同源重组反应通常根据交叉分子或holiday结构(Holiday JunctureStructure)。同源重组反应严格依赖DNA分子之间的同源性。
[0082]同源重组可以用于基因敲除。基因敲除的技术路线如下:
[0083](I)构建重组基因载体；
[0084](2)将重组DNA转入受体细胞核内；
[0085](3)用选择培养基筛选已发生重组的细胞。[0086]在哺乳动物中，还包括步骤(4):将已发生重组的细胞转入胚胎使其生长成为转基因动物，还可以对转基因动物进行形态观察及分子生物学检测。
[0087]发酵生产泰乐菌素B (Tb)
[0088]本发明的菌株可用于通过生物法制备泰乐菌素B或其盐或其衍生物。其中，所述的盐包括(但并不限于):盐酸盐，硫酸盐，磷酸盐、醋酸盐，柠檬酸盐、其他有机羧酸盐等。一方面，所述的衍生物包括(但并不限于):替米考星。
[0089]本发明的发酵生产泰乐菌素B生产方法，除了生产菌不同之外，其他条件与现有技术中发酵生产的方法基本相同，例如对泰乐菌素B粗品的纯化工艺。本发明菌株的发酵条件与一般的链霉菌相近，即在含碳源、氮源和微量元素的培养基中，在PH5.0-9.0(较佳地PH7.0-7.5)和20-45。。(较佳地25_40°C )发酵。在本发明中，“菌丝体”、“发酵液”或“培养液”可通过在适合生长的条件下培养本发明菌株，使其生长至一定的菌丝体浓度来获得。用于培养本发明菌株的培养基中的营养源没有特别的限制。本领域技术人员可以根据公知的技术来选择合适的碳源、氮源和其他营养源。例如，碳源可以是淀粉、糊精、葡萄糖、果糖、蔗糖、甘油、肌醇、甘露醇等。氮源可以是胨、大豆粉、黄豆饼粉、肉膏、蛋白粉、麦皮、米糖、酵母粉、玉米浆、铵盐以及其他有机物或无机含氮化合物。另外，培养基中还可适当加入一些无机盐类，如氯化钠、磷酸盐(如磷酸二氢钾和磷酸氢二钾等)、硫酸锰、硫酸铵、硫酸镁、碳酸钙等金属盐。通常可采用各种已知的常规培养基，如LB琼脂培养基、营养琼脂培养基、葡萄糖酵母膏琼脂培养基和牛肉浸汁琼脂培养基等对本菌株进行斜面固体培养并4°C环境下进行初步保藏。在一个具体实施方案中，用于培养本发明菌株的培养基具有以下组成(％表不质量/体积):酵母提取物0.1%, L-丙氨酸0.02%, L-精氨酸0.02%, L-天冬酰胺0.05%，氯化钠0.25%，硫酸钠1%，可溶性淀粉0.5%，琼脂2%。然而，本领域技术人员应当理解，本发明并不局限于本文中列举的这些具体培养基配方。
[0090]培养本发明中的菌株的温度、pH、气液比、罐压、转速等条件没有特别严格的限制，只要该条件适合该菌的生长即可。在一些较佳的实施方案中，PH宜控制在6.5~8.0之间，培养温度宜在25~40°C之间。应理解，本发明的发酵可以是连续发酵，也可以是间歇式发酵。在本发明的一个较佳的实施方案中，通过以下方法培养得到发酵液和菌丝体:AS-1固体培养基(酵母提取物0.1%，L-丙氨酸0.02%, L-精氨酸0.02%, L-天冬酰胺0.05%,氯化钠
0.25%，硫酸钠1%，可溶性淀粉0.5%，琼脂2%)上30°C培养9天。切下约Icm2的含孢子和菌丝的琼脂块接入一级发酵培养基(黄豆饼粉0.5%，酵母浸出液0.5%，玉米浆0.5%，豆油0.1%)，30°C、250rpm培养48小时。按10%体积的接种量将种子培养液接入发酵培养基(鱼粉1%，玉米粉1.5%，麸质粉1%，黄豆饼粉0.5%，氯化钠0.1%，氯化钾0.1%，磷酸氢二铵0.044%,豆油 4.1%，碳酸钙 0.22%)，30°C>250rpm,培养 8 天。
[0091]工业应用性
[0092]用本发明方法进行遗传改造的菌株性能重现性好，经改造的泰乐菌素产生菌遗传稳定，不易突变，发酵产物中不再产生泰乐菌素A，90wt%以上产物为泰乐菌素B，将产物泰乐菌素B作为前体，可以合成替米考星，极大地简化了替米考星的生产工艺，提高了生产效率，显著降低了替米考星的生产成本。
[0093]本发明的主要优点包括:
[0094](I)对碳霉糖合成基因簇(包含 tylCVI1、tylCV、tylCII1、tylCV 及 tylCII)进行同框敲除，突变体菌株发酵产物90wt%以上为泰乐菌素B，不产生泰乐菌素A。
[0095](2)本发明方法改造的菌株，其发酵产物泰乐菌素B可以直接作为前体，用于后续替米考星的合成。
[0096](3)本发明的泰乐菌素产生菌的遗传改造方法极大简化了替米考星的生产工艺，生产效率高。
[0097]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人，分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
[0098]实施例1
[0099]构建用于同框敲除的重组质粒pLWllOl
[0100]1.设计引物:
[0101]PCR克隆泰乐菌素生物合成基因簇中碳霉糖合成基因簇(包含tylCVII、tylCV、tylCIII、tylCIV及tylCII)上游DNA片段的引物序列如下:
[0102]引物1:5’ -TTAAAGCTTCAACCGCCTGATCGCCAAG-3’ (SEQ ID NO:2)
[0103]引物2:5，-TTATCTAGAGGCTCCCGTGGAATCTCAC-3，(SEQ ID NO:3)
[0104]PCR克隆泰乐菌素生物合成基因簇中碳霉糖合成基因簇(包含tylCVI1、tylCV、tylCII1、tylCIV及tylCII)下游DNA片段的引物序列如下:
[0105]引物3:5，-TTATCTAGACAGTGCCTCTACAACCTGGC-3，(SEQ ID NO:4)
[0106]引物4:5，-TTAGAATTCGGAAGAACGACTCACCCGAG-3’ (SEQ ID NO:5)
[0107]2.PCR 扩增
[0108]以抽提的泰乐菌素产生菌弗氏链霉菌Streptomyces fradiae NRRL2702的总DNA为模板，分别用上述两组特异性引物对泰乐菌素生物合成基因簇中碳霉糖合成基因簇(包含tylCVII、tylCV、tylCIII、tylCIV及tylCII)的上下游序列进行PCR扩增，从而基因簇上游的1565bp的扩增片段与下游的2077bp的扩增片段。
[0109]3.构建重组穿梭质粒
[0110]将两个片段进行凝胶电泳分离，切胶回收纯化。加入HindIII和XbaI消化上游片段，XbaI和EcoRI消化下游片段，回收片段之后，将其一同连入用限制性内切酶HindIII和EcoRI处理过的pKC1139质粒(一种温度敏感的大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒，US5, 955，319)，形成重组质粒 pLWllOl。
[0111]将重组质粒pLWllOl转化常规的大肠杆菌E.coli DH5 α，挑取单克隆菌落于LB培养液(含有阿泊拉霉素抗生素100 μ g/ml)中培养过夜，至菌液较浓。提取重组质粒，经酶切验证后，进行商业测序，结果证明，重组穿梭质粒构建正确。
[0112]实施例2
[0113]碳霉糖合成基因簇同框敲除突变株mLWl 101的构建和筛选
[0114]1.构建同框敲除突变株
[0115]将验证正确的质粒pLWllOl转化入常规的甲基化修饰缺失的大肠杆菌E.coliET12567 (参见US7, 326，782和US7, 105，491)，通过接合转移的方法，将质粒pLWllOl导入泰乐菌素产生菌Streptomyces fradiae NRRL2702中。选出具有阿泊拉霉素抗性的接合子，将接合子置于37°C生长，使质粒pLWllOl中的碳霉糖合成基因簇(包含tylCVI1、tylCV、tylCII1、tylCIV和tylCII)上游或下游片段与染色体上的同源片段发生一次同源重组，然后将37°C生长良好的结合子接入不含任何抗生素的TSB液体培养基(购自SIGMA-ALDRICH公司)中，在30°C下培养两天后取少量菌液重新接种入无抗生素的TSB液体培养基中，如此重复5-6轮之后，将菌液在AS-1固体培养基上划线，挑选丧失阿泊拉霉素抗性的单菌落。
[0116]2.二次筛选
[0117]由于在无抗生素条件下培养，导入链霉菌的质粒中一小部分(约3-5%)会与基因组发生二次同源重组，从而丧失阿泊拉霉素抗性。对于选出的丧失阿泊拉霉素抗性的单菌落，抽提DNA，用PCR方法确定基因型。
[0118]使用的引物为:
[0119]引物5:5，-GAGCCCAAAGCTCTGTCCTC-3’ (SEQ ID NO:6)；
[0120]引物6:5，-CCCCGTACTGTCAGTTCTGC-3’ (SEQ ID NO:7)；
[0121]经PCR产物酶切和测序鉴定，本发明人成功构建了正确缺失了 5144bp碳霉糖合成基因簇的基因工程改造菌株，命名为mLWllOl (又叫:弗氏链霉菌(Sti^ptomyces fradiae)SWL00020)。
[0122]实施例3
[0123]菌株mLWl 101 发酵 [0124]1.种子活化及培养
[0125]将_80°C保存的重组菌株mLWllOl的孢子涂布在AS-1固体培养基(酵母提取物
0.1%，L-丙氨酸0.02%, L-精氨酸0.02%, L-天冬酰胺0.05%,氯化钠0.25%，硫酸钠1%，可溶性淀粉0.5%，琼脂2%)上，30°C培养9天。切下约Icm2的含孢子和菌丝的琼脂块接入一级发酵培养基(黄豆饼粉0.5%，酵母浸出液0.5%，玉米浆0.5%，豆油0.1%)，30°C、250rpm培养48小时，获得用于下一步实验的种子培养液。
[0126]2.扩大培养
[0127]按10%体积的接种量将种子培养液接入发酵培养基(鱼粉1%，玉米粉1.5%，麸质粉1%，黄豆饼粉0.5%，氯化钠0.1%，氯化钾0.1%，磷酸氢二铵0.044%,豆油4.1%，碳酸钙
0.22%)，30°C、250rpm培养8天，收获发酵液，得到含有泰乐菌素B (Tb)的粗产物。低温保存，用于产量检测。
[0128]实施例4
[0129]发酵产物检测
[0130]1.检测产物准备
[0131]发酵液用粉末状分析纯硫酸铝调节pH值为2.5-3.0 (用0.5~5.0的精密pH试纸检验)，离心取上清，用纯水稀释10倍后用于HPLC和LC-MS检测。
[0132]2.HPLC和LC-MS分析检测条件:
[0133]仪器:Agilent1100HPLC 系统；
[0134]柱子=AgilentZORBAX SB-C18 柱(4.6x 250mm)；
[0135]检测波长:UV=289nm;
[0136]流速:0.8ml/min ；
[0137]流动相:A=H20+lwt%。甲酸；B=CH3CN+Iwt%。甲酸；[0138]采用梯度分析，梯度条件见表1，A和B的比例按体积计算。
[0139]表1
[0140]
【权利要求】
1.一种泰乐菌素产生菌，其特征在于，所述的产生菌的发酵产物中，泰乐菌素B(Tb)的相对含量满足下式:
B/ (A+B)≥ 95% 式中， B为发酵产物中泰乐菌素B (Tb)的质量； A为发酵产物中泰乐菌素A(Ta)的质量。
2.如权利要求1所述的泰乐菌素产生菌，其特征在于，所述泰乐菌素产生菌为弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae) SWL00020，保藏编号为:CGMCCN0.6717。
3.如权利要求1所述的泰乐菌素产生菌，其特征在于，所述产生菌的基因组中碳霉糖合成基因簇被失活或敲除； 优选地，所述产生菌中缺失以下5种基因:tylCVI1、tylCV、tylCII1、tylCIV和tylCII ； 或优选地，所述产生菌不表达以下5种基因:tylCVI1、tylCV、tylCII1、tylCIV及tylCI1
4.一种权利要求1所述的泰乐菌素产生菌的用途，其特征在于，它被用做发酵生产泰乐菌素B (Tb)的工程菌株。
5.一种生产泰乐菌素B(Tb)的方法，其特征在于，包括步骤: (a)培养权利要求1所述的泰乐菌素产生菌，从而产生含有泰乐菌素B的发酵产物；和 (b)从发酵产物中分离出泰乐菌素B(Tb)。
6.一种生产替米考星的方法，其特征在于， (a)培养权利要求1所述的泰乐菌素产生菌，从而产生含有泰乐菌素B(Tb)的发酵产物； (b)从发酵产物中分离出泰乐菌素B(Tb);和 (c)将分离出的泰乐菌素B(Tb)转化为替米考星。
7.一种制备泰乐菌素产生菌的方法，其特征在于，包括步骤: (1)构建用于同源重组的载体，所述的载体依次含有以下元件:碳霉糖合成基因簇上游同源臂序列，连接序列，和碳霉糖合成基因簇下游的同源臂序列； (2)将步骤(1)的所述载体导入出发菌株，获得导入载体的菌株，其中所述的出发菌株可发酵产生泰乐菌素A(Ta)和泰乐菌素B (Tb)； (3)从步骤(2)获得的导入载体的菌株中，筛选所述上游同源臂序列和下游同源臂序列与出发菌株的基因组发生了二次同源重组的菌株，从而获得泰乐菌素产生菌。
8.一种用于同源重组的载体，其特征在于，所述载体依次含有以下元件:碳霉糖合成基因簇上游同源臂序列，连接序列，和碳霉糖合成基因簇下游的同源臂序列，且所述载体缺失碳霉糖合成基因簇。
9.如权利要求8所述的载体，其特征在于，所述碳霉糖合成基因簇包含基因tylCVI1、tylCV、tylCII1、tylCIV 及 tylCI； 优选地，所述碳霉糖合成基因簇的序列如SEQ ID N0:1所示。
10.一种宿主细胞，其特征在于，所述细胞含有权利要求8所述的载体或染色体整合有碳霉糖合成基因簇上游和下游同源臂序列和3’同源臂序列，且缺失90%以上的碳霉糖合成基因 族。
【文档编号】C12R1/54GK103849591SQ201210517193
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2012年12月5日 优先权日:2012年12月5日
【发明者】刘 文, 赵群飞, 张华 , 董坤, 彭欣, 李慧芬 申请人:中国科学院上海有机化学研究所, 山东鲁抗舍里乐药业有限公司