一种诱导成纤维细胞转分化为神经元细胞的方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种诱导成纤维细胞转分化为神经元细胞的方法及其应用。具体地，miRNA-302/367簇、miRNA-9和miRNA-124对于成纤维细胞转分化为神经元细胞是不可缺少的，所述的转化过程没有经过明显的干细胞克隆阶段，采用逆转录病毒系统，在人成纤维细胞中稳定高效地过表达上述的miRNA-302/367簇、miRNA-9和miRNA-124，从而调节细胞的一系列生化反应，将成纤维细胞转分化为神经元细胞。本发明还提供了miRNA组合（miRNA-302/367簇、miRNA-9和miRNA-124）的应用。
【专利说明】一种诱导成纤维细胞转分化为神经元细胞的方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术和神经发育领域，具体地，本发明涉及一种诱导成纤维细胞转分化为神经元细胞的方法及其应用。
【背景技术】
[0002]神经系统疾病，特别是中枢神经系统退行性疾病是临床中的常见病和多发病，严重危害着人类的健康。世界卫生组织2007年2月发布的报告指出，全球超过10亿人承受着神经退行性疾病的痛苦，2005年全球有2400多万人患有阿尔茨海默病；其它中枢神经系统退行性疾病，如多发性硬化，亨廷顿氏症和帕金森氏综合症，也给患者带来极大的痛苦。
[0003]由于这些患者的某些神经细胞不可逆的损伤，又很难由自体的神经干细胞补充，除了常规药物治疗之外，细胞替代性治疗具有良好的应用前景，已经成为生物医学研究的执占。
[0004]生物细胞移植疗法是将体外鉴别、分离、纯化、扩增和培养的人体生物细胞种进行移植，从而替代患者体内已经丧失功能的细胞，以达到缓解症状以至于治愈疾病的目的。用于移植的神经细胞的来源是神经退行性疾病细胞替代性治疗研究的一个重点，然而，由于无法像骨髓造血干细胞那样进行有效的动员和采集，临床治疗所需神经细胞的来源受到很大的限制。理想的供体细胞应该能直接从病人身上取得原始细胞，并能够进行大量的扩增，并具有特定的生物 学功能，进入体内后能够发挥相应的生理作用。
[0005]胚胎干细胞具有体外增殖和多向分化的特点，可以作为临床用种子的来源，然而其不可避免的产生的免疫排斥反应，制约了其进一步的应用。
[0006]2007年，科学家将皮肤细胞转换成诱导性多潜能干细胞，它与胚胎干细胞具有相似功能，同时回避了胚胎干细胞的伦理争议，还解决了干细胞移植医学上的免疫排斥问题。相较于克隆和胚胎干细胞的限制性，诱导性多潜能干细胞无疑更进一步，但它的缺点也很明显。它不易获取，成功率极低；耗时久且稳定性相对欠缺，具有致癌风险。
[0007]为了解决这些潜在的隐患，直接将皮肤细胞转化为神经元是一个良好的研究方向。将成纤维细胞转分化为神经元细胞的方法具有巨大的应用前景，因此迫切需要进行相应的开发。
【发明内容】
[0008]本发明的目的就是提供一种诱导成纤维细胞转分化为神经元细胞的方法及其应用。
[0009]在本发明的第一方面，提供了一种miRNA组合的用途，所述的miRNA组合包括:miRNA-302/367簇、miRNA-9和miRNA-124 ;并且，所述的miRNA组合用于将成纤维细胞转分化为神经元细胞，或用于制备将成纤维细胞转分化为神经元细胞的试剂。
[0010]在另一优选例中，所述的miRNA组合还具有任选自下组的特征或其组合:
[0011](I)miRNA-302/367簇的前体具有SEQ ID N0.:1所示的核苷酸序列；[0012](2) miRNA-9的前体具有SEQ ID N0.:2所示的核苷酸序列；
[0013](3) miRNA-124的前体具有SEQ ID N0.: 3所示的核苷酸序列；
[0014](4) miRNA-302/367簇具有SEQ ID N0.:4_8任一所示的成熟的核苷酸序列；
[0015](5) miRNA-9具有SEQ ID N0.: 9所示的成熟的核苷酸序列；
[0016](6)miRNA-124具有SEQ ID N0.: 10所示的成熟的核苷酸序列。
[0017]在另一优选例中，所述用于制备将成纤维细胞转分化为神经元细胞的试剂为:质粒、黏粒、或病毒载体。
[0018]在本发明的第二方面，提供了一种核苷酸载体，所述的载体上整合有编码miRNA-302/367 簇、miRNA-9 和 miRNA-124 的核苷酸序列。
[0019]在另一优选例中，所述的核苷酸载体为病毒载体，较佳地为慢病毒载体。
[0020]在本发明的第三方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有第二方面所述的核苷酸载体，或所述的宿主细胞的染色体整合有编码miRNA-302/367簇、miRNA-9和miRNA-124的核苷酸序列。
[0021]在另一优选例中，所述的宿主细胞来源于人或非人哺乳动物。
[0022]在另一优选例中，所述 的宿主细胞为成纤维细胞。
[0023]在另一优选例中，所述的宿主细胞为人皮肤成纤维细胞。
[0024]在本发明的第四方面，提供了一种将成纤维细胞转分化为神经元细胞的方法，包括步骤:
[0025](I)在所述的成纤维细胞中过表达miRNA-302/367簇、miRNA-9和miRNA-124，获得miRNA-302/367簇、miRNA-9和miRNA-124均过表达的成纤维细胞；
[0026](2)将步骤⑴获得的成纤维细胞诱导分化为神经元细胞。
[0027]在另一优选例中，所述的成纤维细胞为人皮肤成纤维细胞。
[0028]在另一优选例中，在步骤⑴中，包括步骤:用分别具有编码miRNA-302/367簇、miRNA-9或miRNA-124的核苷酸序列的病毒载体，转染所述的成纤维细胞。
[0029]在另一优选例中，具有编码miRNA-302/367簇的核苷酸序列的病毒载体还包括EF-1a启动子，和/或报告基因。
[0030]在另一优选例中，具有编码miRNA-9或miRNA-124的核苷酸序列的病毒载体还包括Hl a启动子，和/或报告基因。
[0031]在另一优选例中，所述的报告基因为GFP报告基因。
[0032]在本发明的第五方面，提供了一种神经元细胞，所述的细胞是使用第四方面所述的方法制备的。
[0033]在另一优选例中，所述的神经元细胞中过表达miRNA-302/367簇、miRNA-9和miRNA-124。
[0034]在本发明的第六方面，提供了第五方面所述的神经元细胞的用途，所述的神经元细胞用于制备预防或治疗神经系统疾病的药物组合物。
[0035]在另一优选例中，所述的神经系统疾病为神经退行性疾病。
[0036]在另一优选例中，所述的神经系统疾病选自下组:亨廷顿氏症、帕金森氏症、阿尔茨海默病。
[0037]在本发明的第七方面，提供了一种组合物，所述的组合物包括:第五方面所述的神经元细胞。
[0038]在另一优选例中，所述的组合物为药物组合物、食品组合物、保健品组合物等。
[0039]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
【专利附图】
【附图说明】
[0040]下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
[0041]图1显示了组织块培养法获得的人类皮肤成纤维细胞；其胞体较大，细胞界限清楚，立体感强，以梭形为主，也可见到不规则三角形、多角形等各种形状的细胞。
[0042]图2显示了慢病毒感染后的 各miRNA表达情况；图2a为miRNA302_abcd/367的相对表达量；图2b为miRNA-9的相对表达量；图2c为miRNA-124的相对表达量；对照组为感染空载体的皮肤成纤维细胞；从图中可以看出，感染后的皮肤成纤维细胞中，相对应的miRNA表达均有显著提高。
[0043]图3显示了皮肤成纤维细胞感染后的变化情况；从图3a到图3c分别显示报道基因GFP的荧光表达，皮肤成纤维细胞感染后随着时间的变化情况；其中图3a表示7天时的细胞形态；图3b表示14天时的细胞形态；图3c表示21天时的细胞形态；从图中可以看出，14天的时候有少量神经元样细胞开始出现，随后逐渐增加，21天的时候有大量神经元出现。
[0044]图4为本发明一个具体实施例中所获得的神经元；神经元胞体小，有多种形式的树突和轴突，明显区别于成纤维细胞的形态。
[0045]图5为神经元的免疫荧光鉴定；图5a为MAP2的免疫荧光染色，图5b为β -1II Tubulin的免疫荧光染色。
[0046]图6为过表达miRNA-302/367簇、miRNA-9和miRNA-124实验组的流式检测结果，结果表明，33.04%的细胞表达神经细胞特有的标记物MAP2。
[0047]图7显示所获得的神经元的离子电流分析，表明所述神经元具有钠电流以及钾电流。
[0048]图8为仅表达miRNA-9和miRNA-124实验组的流式检测结果，结果表明，表达神经细胞特有的标记物MAP2的细胞比例为2.31%，远远低于组合使用miRNA-302/367簇、miRNA-9 和 miRNA-124 的效率。
【具体实施方式】
[0049]本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，miRNA-302/367簇、miRNA-9和miRNA-124对于成纤维细胞转分化为神经元细胞是不可缺少的，所述的转化过程没有经过明显的干细胞克隆阶段。采用逆转录病毒系统，在人成纤维细胞中稳定高效地过表达上述的miRNA-302/367簇、miRNA-9和miRNA-124，从而调节细胞的一系列生化反应，将成纤维细胞转分化为神经元细胞。在此基础上完成了本发明。
[0050]miRNA及其前体[0051]本发明提供了涉及用于将成纤维细胞转分化为神经元细胞一组microRNA或miRNA, microRNA与miRNA可以互换使用。
[0052]如本文所用，所述的“miRNA”是指一类RNA分子，从可形成miRNA前体的转录物加工而来。成熟的miRNA通常具有I扩25个核苷酸(nt)，也不排除具有其它数目核苷酸的miRNA分子。miRNA通常可被Northern印迹检测到。
[0053]人来源的miRNA可被从人细胞中分离。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。[0054]miRNA 可从前体 miRNA (Precursor miRNA, Pre-miRNA)加工而来，所述的前体miRNA可折叠成一种稳定的茎环(发夹)结构，所述的茎环结构长度一般在5(Tl00bp之间。所述的前体miRNA可折叠成稳定的茎环结构，茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。所述的前体miRNA可以是天然的或是人工合成的。
[0055]前体miRNA可被剪切生成成熟的miRNA，所述的miRNA可与编码基因的mRNA的至少一部分序列基本上互补。如本文所用，“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70%的核苷酸是互补的；优选的，至少有80%的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90%的核苷酸是互补的；进一步优选的，至少有95%的核苷酸是互补的；如98%,99%或100%。一般地，两条足够互补的分子之间可以具有最多40个不匹配的核苷酸；优选的，具有最多30个不匹配的核苷酸；更优选的，具有最多20个不匹配的核苷酸；进一步优选的，具有最多10个不匹配的核苷酸，如具有1、2、3、4、5、8、11个不匹配的核苷酸。
[0056]如本文所用，“茎环”结构也被称作“发夹”结构，是指一种核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的，核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成莖环结构。
[0057]本发明所述的一组miRNA是指:
[0058]1.miRNA302/367簇、或经修饰的miRNA302/367簇衍生物、或与miRNA302/367 功能相同或基本相同的微小RNA或经修饰的miRNA衍生物；
[0059]2.miRNA9、或经修饰的miRNA9衍生物、或与miRNA9功能相同或基本相同的微小RNA或经修饰的miRNA衍生物；
[0060]3.miRNA124、或经修饰的miRNA124衍生物、或与miRNA124功能相同或基本相同的微小RNA或经修饰的miRNA衍生物.[0061]在本发明的一个优选例中，miRNA302/367簇前体的核苷酸序列如SEQ IDN0.:1所/Jn ο
[0062]在本发明的一个优选例中，miRNA9前体的核苷酸序列如SEQ ID N0.:2所示。
[0063]在本发明的一个优选例中，miRNA124前体的核苷酸序列如SEQ ID N0.:3所示。
[0064]miRNA302/367簇可以在宿主细胞内剪切为5个成熟的序列，核苷酸序列如SEQ IDN0.:4-8任一所示。
[0065]miRNA9前体的核苷酸序列可以在宿主细胞内剪切为成熟的序列，核苷酸序列如SEQ ID N0.:9 所示。
[0066]miRNA124前体的核苷酸序列可以在宿主细胞内剪切为成熟的序列，核苷酸序列如SEQ ID N0.:10 所示。
[0067]在另一优选例中，所述的miRNA来源于人或非人哺乳动物，较佳地为人。
[0068]所述的“与miRNA功能相同或基本相同”是指保留了所述miRNA的≥40%,≥50%、≥60%、≥70%、≥80%、≥90%的生物学功能。
[0069]本发明还包括各个miRNA变体和衍生物，本领域的普通技术人员可以使用通用的方法对miRNA进行修饰，修饰方式包括(但不限于):甲基化修饰、烃基修饰、糖基化修饰(如2-甲氧基-糖基修饰、烃基-糖基修饰、糖环修饰等)、核酸化修饰、肽段修饰、脂类修饰、卤素修饰、核酸修饰(如“ TT ”修饰)等。
[0070]根据本发明所提供的miRNA序列，可设计出在被导入后可被加工成可影响相应的mRNA表达的miRNA的多核苷酸构建物，也即所述多核苷酸构建物能够在体内上调相应的miRNA的量。
[0071]由此，本发明提供了一种分离的多核苷酸(构建物)，所述的多核苷酸(构建物)可被人细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA可被宿主细胞剪切且表达成所述的miRNA。
[0072]作为本发明的一种优选方式，所述的多核苷酸构建物含有式II所示的结构:
[0073]Seq 正向-X-Seq 反向
[0074]式II
[0075]式II 中，
[0076]Seq1^1为可在细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，Seqfi^1为与Seq1^1基本上互补的核苷酸序列；或者，Seq&@为可在细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq1向为与Seq1^1基本上互补的核苷酸序列；X为位于间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seqtt和Seqi^不互补；
[0077]式I所示的结构在转入细胞后，形成式III所示的二级结构:
[0078]
【权利要求】
1.一种miRNA组合的用途，其特征在于，所述的miRNA组合包括:miRNA_302/367簇、miRNA-9和miRNA-124 ;并且，所述的miRNA组合用于将成纤维细胞转分化为神经元细胞，或用于制备将成纤维细胞转分化为神经元细胞的试剂。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的miRNA组合还具有任选自下组的特征或其组合: (1)miRNA-302/367簇的前体具有SEQID N0.:1所示的核苷酸序列； (2)miRNA-9的前体具有SEQ ID N0.: 2所示的核苷酸序列； (3)miRNA-124的前体具有SEQ ID N0.: 3所示的核苷酸序列； (4)miRNA-302/367簇具有SEQID N0.: 4_8任一所示的成熟的核苷酸序列； (5)miRNA-9具有SEQ ID N0.: 9所示的成熟的核苷酸序列； (6)miRNA-124具有SEQID N0.: 10所示的成熟的核苷酸序列。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述用于制备将成纤维细胞转分化为神经元细胞的试剂为:质粒、黏粒、或病毒载体。
4.一种核苷酸载体，其特征在于，所述的载体上整合有编码miRNA-302/367簇、miRNA-9和miRNA-124的核苷酸序列。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求4所述的核苷酸载体，或所述的宿主细胞的染色体整合有编码miRNA-302/367簇、miRNA-9和miRNA-124的核苷酸序列。
6.一种将成纤维细胞转分化 为神经元细胞的方法，其特征在于，所述方法包括步骤: (1)在所述的成纤维细胞中过表达miRNA-302/367簇、miRNA-9和miRNA-124，获得miRNA-302/367簇、miRNA-9和miRNA-124均过表达的成纤维细胞； (2)将步骤(1)获得的成纤维细胞诱导分化为神经元细胞。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，包括步骤:用分别具有编码miRNA-302/367簇、miRNA-9或miRNA-124的核苷酸序列的病毒载体，转染所述的成纤维细胞。
8.—种神经元细胞，其特征在于，所述的细胞是使用权利要求6所述的方法制备的。
9.权利要求8所述的神经元细胞的用途，其特征在于，所述的神经元细胞用于制备预防或治疗神经系统疾病的药物组合物。
10.一种组合物，其特征在于，所述的组合物包括:权利要求8所述的神经元细胞。
【文档编号】C12N5/0793GK103849601SQ201210517195
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2012年12月5日 优先权日:2012年12月5日
【发明者】顾红峰, 王蓓, 周晨, 楼觉人 申请人:上海生物制品研究所有限责任公司