抗癌剂、癌细胞的凋亡诱导方法及抗癌剂的筛选方法

专利名称：抗癌剂、癌细胞的凋亡诱导方法及抗癌剂的筛选方法
技术领域：
本发明涉及可以通过特异性抑制作为核内蛋白质的RBM8A或Magoh的表达来诱导癌细胞的细胞死亡的抗癌剂、使用了该抗癌剂的癌细胞的凋亡诱导方法、含有该抗癌剂作为有效成分的药物组合物及通过测定RBM8A或Magoh的表达量的抗癌剂的筛选方法。
背景技术：
在癌的诊断及治疗领域，目前为止，利用各种蛋白质组学分析，鉴定了在癌细胞中特异性表达的蛋白质。一直以来，在以所述蛋白质作为靶的癌治疗的研究中，焦点集中在利用该蛋白质的表达及/或活性的增强或抑制进行控制。序列号1表示的核内蛋白质即人RBM8A(RNA binding motif protein 8A)为分子量比较低的蛋白质，与被报道了与各种因子的相互作用的黑腹果蝇的Y14具有同源性。此处，关于Y14，报道了其具有RNA结合基序，与作为其它核内蛋白质的Magoh形成异源二聚体，与RNA结合，通过在黑腹果蝇的培养细胞中抑制其表达，能够抑制细胞增殖。但是，关于在其他物种中与Y14具有同源性的蛋白质，其功能不明确，特别是也没有针对与DNA复制和细胞分裂相关功能的关联性的任何报道等，也没有明确是否在细胞周期的任一阶段抑制细胞的增殖(参见非专利文献1)。特别是，仅通过引起细胞的增殖抑制不能作为抗癌剂使用， 只有诱导凋亡等细胞死亡才能够用作抗癌剂，所以也不明确抑制Y14在其它生物中的相同蛋白质的因子能否用于含有抗癌剂等的药物组合物。另一方面，已知序列号5表示的蛋白质即人Magoh与人RBM8A形成异源二聚体，与 RNA结合。但是，尚不清楚抑制所述Magoh的因子是否能用于含有抗癌剂等的药物组合物中。目前，RNA干扰(RNA interference =RNAi)技术被频繁地用于生命科学领域的研究中，已经广泛认识了其有用性。此处，所谓RNAi，是指通过双链RNA其序列特异性地分解 mRNA，结果抑制基因的表达的现象。自2001年报道了作为21个碱基的低分子双链RNA的 siRNA(small interference RNA)能够在哺乳动物的细胞内介导RNAi以来，siRNA被频繁用作靶基因的表达抑制方法，并且近年来也报道了用于在RNAi中获得更高效果的、siRNA 的序列选择基准(参见非专利文献2及3)。也期待RNAi技术应用于药品和包括癌的各种难治性疾病的治疗。例如，专利文献 1中公开了间质性肺疾病治疗剂，其特征在于，含有siRNA等抑制特定的蛋白质的表达的物质作为有效成分。—直以来，已知很多抗癌剂显示出在细胞周期的S期特异性抑制细胞周期的发展的活性，与此相对，紫杉醇等紫杉烷类抗癌剂通过与微管结合，抑制微管的解聚，由此抑制M 期的细胞周期的发展。如上所述，期待抑制M期的细胞周期的发展的抗癌剂能够广泛用于癌治疗。专利文献1 日本特开2007-319009号公报非专利文献 1 :Herve Le Hir et al. , "The protein Mago provides a linkbetween splicing and mRNA”，EMBO reports, 12, p.1119-1124(2001)非专禾Ij 文献 2 :Elbashir S. Μ. et al. ,"Duplexes of 21—nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells，，，Nature, 411 (6836), p. 494-498(2001)非专禾Ij 文献 3 :Reynolds A. et al. ,"Rational siRNA design for RNA interference", Nature Biotechnol.，22(3)，p.326-330(2004)

发明内容
但是，担心紫杉醇等紫杉烷类抗癌剂显示白细胞和嗜中性粒细胞的减少、对末梢神经的损伤、恶心和呕吐等副作用，寻求开发出与紫杉烷类抗癌剂不同、抑制M期的细胞周期的发展的抗癌剂。本发明人等鉴于上述课题进行了深入研究。结果发现人的Y14的相同蛋白质即 RBM8A局部存在于中心体、纺锤丝、收缩管，通过抑制RBM8A的表达来抑制微管蛋白的正常聚合，使癌细胞在M期集聚；通过抑制RBM8A的表达，在M期集聚的细胞中引起凋亡。另外， 还发现通过抑制Magoh的表达也抑制了 RBM8A的表达，引起凋亡。基于上述发现，本发明人等发现抑制RBM8A或Magoh的表达的物质能够用作抗癌剂，完成了本发明。具体而言，本发明提供了以下方案。(1) 一种抗癌剂，含有特异性抑制序列号1表示的蛋白质或其同种型的表达及/或功能的化合物。(1)所述的抗癌剂，能够特异性抑制序列号1表示的RBM8A或其同种型的表达及 /或功能。此处，通过抑制癌细胞中的RBM8A的表达及/或功能，能够使细胞周期在M期停止，抑制细胞的增殖，因此，能够抑制癌细胞的增殖，同时诱导癌细胞的凋亡，能够治愈癌。另外，本发明中“特异性抑制”是指在机体内，抗癌剂仅抑制序列号1表示的蛋白质的表达及/或功能，不具有脱靶效应。(2)如(1)所述的抗癌剂，其中，上述化合物为特异性抑制序列号1表示的蛋白质或其同种型的表达的双链siRNA，构成上述双链siRNA的RNA分子的至少一方能够与序列号 2表示的mRNA互补结合。(2)所述的发明中，作为特异性抑制序列号1表示的蛋白质或其同种型的表达的化合物，规定了双链siRNA。如果为具有能够与编码序列号1表示的蛋白质的、序列号2表示的mRNA互补结合的RNA链的双链siRNA，则能够抑制序列号1表示的蛋白质或其同种型的表达，因此能够优选用作(1)所述的抗癌剂。需要说明的是，本发明中“siRNA”是能够介导RNAi的短链RNA分子，具有21 27 个碱基。(3) —种抗癌剂，含有特异性抑制序列号3表示的蛋白质或其同种型的表达及/或功能的化合物。(3)所述的抗癌剂能够特异性抑制序列号3表示的Magoh或其同种型的表达及/ 或功能。此处，抑制癌细胞中的Magoh的表达及/或功能时，也抑制RBM8A的表达及/或功能。因此，能够抑制癌细胞的增殖，同时诱导癌细胞的凋亡，能够治愈癌。(4)如(3)所述的抗癌剂，其中，上述化合物是特异性抑制序列号3表示的蛋白质或其同种型的表达的双链siRNA，构成上述双链siRNA的RNA分子的至少一方能够与序列号 4表示的mRNA互补结合。(4)所述的发明中，作为特异性抑制序列号3表示的蛋白质或其同种型的表达的化合物，规定了双链siRNA。如果为具有能够与编码序列号3表示的蛋白质的、序列号4表示的mRNA互补结合的RNA链的双链siRNA，则能够抑制序列号3表示的蛋白质或其同种型的表达，因此能够优选用作( 所述的抗癌剂。(5)如(1) (4)中任一项所述的抗癌剂，用于非小细胞肺癌或乳癌的治疗。本发明的抗癌剂特别优选用于非小细胞肺癌或乳癌的治疗。因此，根据(5)所述的发明，能够特异性抑制癌细胞的增殖，特异性诱导癌细胞的凋亡。(6) 一种药物组合物，以(1) (5)中任一项所述的抗癌剂作为有效成分。(6)所述的发明中，将(1) (5)所述的发明以药物组合物的发明的形式进行了规定。因此，根据(6)所述的发明，能够得到与(1) (5)所述的发明同等的效果。(7) 一种癌细胞的凋亡诱导方法，使用(1) (5)中任一项所述的抗癌剂。(7)所述的发明中，将(1) (5)所述的发明以癌细胞的凋亡诱导方法的发明的形式进行了规定。因此，根据(7)所述的发明，能够得到与(1) (5)所述的发明同等的效^ ο(8) 一种抗癌剂的筛选方法，包括下述步骤使分离的癌细胞与候补物质接触的步骤；在上述癌细胞中，检测序列号1或3表示的蛋白质或它们的同种型的表达及/或功能的步骤；及从上述候补物质中选择使序列号1或3表示的蛋白质或它们的同种型的表达及 /或功能下降的候补物质的步骤。(9)如(8)所述的抗癌剂的筛选方法，其中，在检测序列号1或3表示的蛋白质或它们的同种型的表达及/或功能的上述步骤中，检测序列号1或3表示的上述蛋白质、及在机体内与序列号1或3表示的上述蛋白质相互作用的其它蛋白质的相互作用或复合体形成，在从上述候补物质中选择使序列号1或3表示的蛋白质或它们的同种型的表达及/或功能下降的候补物质的上述步骤中，选择使序列号1或3表示的上述蛋白质与上述其它蛋白质的相互作用或复合体形成下降的候补物质。(10)如(8)所述的抗癌剂的筛选方法，其中，在检测序列号1或3表示的蛋白质或它们的同种型的表达及/或功能的上述步骤中，测定表达序列号2或4表示的mRNA的基因的表达量，在从上述候补物质中选择使序列号1或3表示的蛋白质或它们的同种型的表达及/或功能下降的候补物质的上述工序中，选择使表达序列号2或4表示的mRNA的基因的表达量下降的候补物质。(8)至(10)所述的发明中，规定了以序列号1表示的RBM8A、或序列号3表示的 Magoh的表达及/或功能的抑制活性作为指标的抗癌剂的筛选方法。如上所述，通过抑制癌细胞中的RBM8A的表达，能够使细胞周期在M期停止，抑制细胞的增殖，诱导凋亡。另外，通过抑制癌细胞中的Magoh的表达，能够抑制细胞的增殖，诱导凋亡。因此，根据(8)至(10) 所述的发明，能够筛选可以通过抑制RBM8A或Magoh的表达来抑制细胞增殖的抗癌剂。(11)如(10)所述的抗癌剂的筛选方法，其中，上述候补物质为具有3’悬突体的双链siRNA，构成上述双链siRNA的RNA分子的至少一方能够与序列号2或4表示的mRNA互补结合。
(11)所述的发明是抗癌剂的筛选方法，所述筛选方法以具有能够与编码RBM8A或 Magoh的mRNA互补结合的RNA分子的双链siRNA作为候补物质。具有能够与编码蛋白质的mRNA互补结合的RNA分子的双链siRNA有抑制该蛋白质的表达的倾向，因此，通过使用上述双链siRNA作为候补物质，能够有效地筛选抗癌剂。(12)如(8) (11)中任一项所述的抗癌剂的筛选方法，其中，在使分离的癌细胞与候补物质接触的上述步骤中，在候补物质的存在下培养癌细胞。(13)如(8) (12)中任一项所述的抗癌剂的筛选方法，其中，在检测序列号1或 3表示的蛋白质或它们的同种型的表达及/或功能的上述步骤中，使用针对序列号1或3表示的蛋白质的抗体，测定上述蛋白质的表达及/或功能。(12)及(13)所述的发明中，规定了⑶ (11)所述的发明中的具体的方法。因此，根据(12)及(13)所述的发明，能够获得与(8) (11)所述的发明同等的效果。本发明的抗癌剂能够特异性抑制序列号1表示的RBM8A、序列号5表示的Magoh、 或它们的同种型的表达及/或功能。此处，通过抑制癌细胞中的RBM8A的表达及/或功能， 能够使细胞周期在M期停止，抑制细胞的增殖。另外，通过抑制癌细胞中的Magoh的表达， 能够抑制细胞的增殖。因此，能够抑制癌细胞增殖，同时诱导癌细胞的凋亡，能够治愈癌。


图1为表示细胞内的RBM8A的局部存在部位的图。图2为表示细胞内的RBM8A的局部存在部位的图。图3为表示转染了 RBM8A_siRNA(IG-B)的细胞的光学显微镜图像的图。图4为表示转染了 RBMSA-siRNA⑴ (3)的细胞的利用抗磷酸化组蛋白H3抗体的免疫染色的结果的图。图5为表示用抗磷酸化组蛋白H3抗体染色后的细胞(M期的细胞)相对于用DAPI 染色后的细胞的比例的图。图6为表示转染了 RBM8A-siRNA(l) (3)的细胞的RBM8A的表达量的图。图7为表示转染了 RBMSA-siRNA⑵的细胞的流式细胞术的结果的图。图8为表示转染了 RBMSA-siRNA⑵的细胞的相差显微镜图像的图。图9为表示转染了 RBMSA-siRNA O)的细胞的利用抗Y -微管蛋白抗体的免疫染色的结果的图。图10为表示显示出转染了 RBMSA-SiRNA(I) (3)的细胞中的异常的微管形态的细胞的比例的图。图11为表示转染了 RBM8A-siRNA⑴ (3)的细胞中的胱天蛋白酶3/7的活性的图。图12为表示转染了 RBM8A-siRNA(IG-B)、(IG-F)的细胞中的RBM8A的表达量的图。图13为表示转染了 RBM8A-siRNA(IG-B)、(IG-F)的细胞的吉姆萨染色图像的图。图14为表示转染了 Magoh-siRNA(l)、(2)的细胞中的RBM8A及Magoh的表达量的图。图15为表示对转染了 Magoh-SiRNA(I)、(2)的细胞的细胞周期进行分析的结果的图。
具体实施例方式以下，详细说明本发明的实施方式。<抗癌剂>本发明的抗癌剂含有特异性抑制序列号1或3表示的蛋白质的表达及/或功能的化合物。作为上述化合物，例如可以举出特异性抑制序列号1或3表示的蛋白质的表达的双链siRNA，且构成上述双链siRNA的RNA分子的至少一方能够与序列号2或4表示的mRNA
互补结合。如下所述，序列号1表示的蛋白质即RBM8A局部存在于细胞核内、中心体、纺锤丝、 收缩环内。而且，通过在癌细胞内抑制RBM8A的表达，细胞周期在M期停止，该癌细胞因凋亡导致细胞死亡。因此，通过特异性抑制序列号1表示的蛋白质即RBM8A的表达及/或功能，能够抑制癌细胞增殖，同时诱导癌细胞的凋亡。另外，序列号3表示的蛋白质即Magoh能与RBM8A形成异源二聚体。而且，通过在癌细胞中抑制Magoh的表达，该癌细胞因凋亡导致细胞死亡。因此，通过特异性抑制序列号 3表示的蛋白质即Magoh的表达及/或功能，能够抑制癌细胞增殖，同时诱导癌细胞的凋亡。作为抑制RBM8A的本发明的抗癌剂，可以举出如下得到的双链siRNA，S卩，使在序列号5 9中任一个表示的RNA的3’末端具有由胸苷核苷酸(Thymidine ribonucleotide) 的二聚体形成的悬突体的RNA链、和在序列号5 9中任一个表示的RNA的互补链的3’末端具有由胸苷核苷酸的二聚体形成的悬突体的RNA链配对得到。由于上述双链siRNA能够与编码RBM8A且序列号2表示的mRNA特异性结合，所以含有该双链siRNA的抗癌剂在癌细胞内能够特异性抑制序列号1表示的蛋白质即RBM8A的表达。另外，作为抑制Magoh的本发明的抗癌剂，可以举出如下得到的双链siRNA，即，使在序列号10或11表示的RNA的3’末端具有由胸苷核苷酸的二聚体形成的悬突体的RNA 链、和在序列号10或11表示的RNA的互补链的3’末端具有由胸苷核苷酸的二聚体形成的悬突体的RNA链配对得到。由于上述双链siRNA能够与编码Magoh、且序列号4表示的mRNA特异性结合，所以含有该双链siRNA的抗癌剂在癌细胞内能够特异性抑制序列号3表示的蛋白质即Magoh的表达。此处，构成本发明的抗癌剂的双链SiRNA可以在体外化学或酶合成，也可以在体内合成，其制造方法没有特别限定，但优选利用现有公知的方法化学合成进行制造。如果为化学合成的双链siRNA，则双链siRNA的浓度调节和用于防止杂菌混入的操作变得容易，能够得到RNA干扰的效果优异、安全性高的双链siRNA。例如，19个碱基对的一方的互补链用序列号5表示，关于2个碱基的3’悬突体为胸苷核苷酸的二聚体的双链siRNA，优选如下配对分别化学合成在序列号5表示的RNA链的3’末端加入了 2个碱基的胸苷核苷酸所得的序列、及在与序列号5表示的RNA链互补结合的RNA链的3’末端加入了 2个碱基的胸苷核苷酸所得的序列，将上述二条RNA链在配对的条件下进行配对。
本发明的抗癌剂适用的疾病只要为癌症即可，没有特别限定，可以举出非小细胞肺癌、乳癌、卵巢癌、胃癌及食道癌。其中，优选非小细胞肺癌及乳癌。<药物组合物>本发明还涉及以本发明的抗癌剂作为有效成分的药物组合物。本发明的抗癌剂能够在体外对细胞和组织进行使用，除此之外，也可以对人进行临床应用。对人进行临床应用时，优选根据需要混合药学上允许的载体，以含有抗癌剂的药物组合物的形态给予。其中， 作为药学上允许的载体，没有特别限定，可以优选使用能够提高本发明的抗癌剂向作为靶的癌组织或癌细胞中浸透的效率的载体等。作为上述载体，可以举出用于防止在机体内的双链SiRNA的分解、提高细胞内透过性的阳离子脂质体(例如参见Yano J. et al.，Clin Cancer Res. ,10(22), p. 7721-7726(2004))。另外，对于构成本发明的抗癌剂的双链siRNA，为了防止在机体内的分解，可以进行化学修饰(例如参见 Rossi J. J.，Nature, 432 (7014), p. 155-156(2004)； Soutschek J. et al.，Nature,432(7014)，p.173-178(2004)等)。本发明的药物组合物的剂型没有特别限定，可以举出注射剂、膏剂、软膏、混悬剂寸。<癌细胞的凋亡诱导方法>本发明还涉及使用了本发明的抗癌剂的癌细胞的凋亡诱导方法。所述癌细胞的凋亡诱导方法通过使本发明的抗癌剂与分离的癌细胞、或含有癌细胞的细胞群接触而进行。本发明的癌细胞的凋亡诱导方法中，使本发明的抗癌剂接触时，使至少含有癌细胞的细胞群与以50 80%的浓度含有本发明的抗癌剂的溶液接触，在36 37°C下放置 4 72小时。通过进行上述操作，构成本发明的抗癌剂的双链siRNA被摄入细胞内，抑制了序列号1表示的蛋白质即RBM8A、或序列号3表示的蛋白质即Magoh的表达，由此能够抑制癌细胞增殖，同时诱导癌细胞的凋亡。〈抗癌剂的筛选方法〉本发明还涉及抗癌剂的筛选方法。本发明的抗癌剂的筛选方法包括下述步骤使分离的癌细胞与候补物质接触的步骤(接触步骤)；在上述癌细胞中，检测序列号1或3表示的蛋白质或它们的同种型的表达及/或功能的步骤(测定步骤)；及从上述候补物质中选择使序列号1或3表示的蛋白质或它们的同种型的表达及/或功能下降的候补物质的步骤(选择步骤)。(接触步骤)在接触步骤中，使分离的癌细胞与候补物质接触。对于接触步骤中使用的癌细胞， 没有特别限定，例如可以举出肺癌细胞、子宫颈癌细胞、胰腺癌细胞等。另外，对于使癌细胞与候补物质接触的方法，可以在候补物质的存在下培养癌细胞，也可以在癌细胞内产生候补物质。例如，可以举出下述方法，S卩，在候补物质的存在下培养癌细胞时，用96孔微孔板等培养癌细胞，向其中加入候补物质，在36 37°C下培养4 72小时，之后，除去候补物质。另外，候补物质为双链siRNA时，可以在规定的条件下，将产生作为候补物质的双链siRNA的DNA片段导入载体，在导入了该DNA片段的癌细胞内诱导双链siRNA的产生。
作为候补物质，例如可以举出下述双链siRNA，所述双链SiRNA具有3’悬突体，且构成双链siRNA的RNA分子的至少一方能够与序列号2或4表示的mRNA互补结合。此时， 对于候补物质，可以在体外化学或酶合成，也可以在体内合成。特别是在体外酶合成时，可以以RBM8A的cDNA作为原料，进行限制酶反应或连接反应，由此合成。(测定步骤)在测定步骤中，在癌细胞中检测序列号1或3表示的蛋白质或它们的同种型的表达及/或功能。作为检测序列号1或3表示的蛋白质或它们的同种型的表达的方法，没有特别限定，可以举出测定蛋白质的表达量的免疫印迹法、测定mRNA的表达量的RNA印迹法、 或抗体染色法等。另外，作为检测序列号1或3表示的蛋白质或它们的同种型的功能的方法，例如可以举出下述方法使用免疫沉降法，从癌细胞的提取液中使序列号1表示的蛋白质即 RBM8A、或序列号3表示的蛋白质即Magoh沉降，通过免疫印记法确认有无与RBM8A或Magoh 共沉降的蛋白质，检测有无RBM8A或Magoh与其他蛋白质的相互作用及复合体形成的方法； 将RBM8A或Magoh、及已知与其相互作用的蛋白质通过抗体染色法进行染色，确认两者是否共同局部存在的方法等。特别是，使用免疫印迹法或抗体染色法时，在测定步骤中，优选使用针对序列号1 或3表示的蛋白质的抗体测定上述蛋白质的表达量。此时，作为该抗体，可以使用单克隆抗体，也可以使用多克隆抗体，但优选使用单克隆抗体。(选择步骤)在选择步骤中，从候补物质中选择使序列号1或3表示的蛋白质或它们的同种型的表达及/或功能下降的候补物质。在选择步骤中，具体而言，根据测定步骤中具体实施的方法，选择使表达序列号2或4表示的mRNA的基因的表达量下降的候补物质，或者可以选择使序列号1或3表示的蛋白质与上述其他蛋白质的相互作用或复合体形成下降的候补物质，可以根据测定步骤中实施的方法，利用现有公知的选择方法选择候补物质。实施例以下，参照附图详细说明本发明的实施例。需要说明的是，本发明并不限定于以下所示的实施例。在以下的实施例中，作为抑制RBM8A的双链siRNA，使用下述5种物质。RBM8A-siRNA(IG-B)使在序列号5表示的RNA的3’末端具有由胸苷核苷酸的二聚体形成的悬突体的RNA链、与在序列号5表示的RNA的互补链的3’末端具有由胸苷核苷酸的二聚体形成的悬突体的RNA链进行配对得到的双链siRNA。RBM8A-siRNA(IG-F)使在序列号6表示的RNA的3’末端具有由胸苷核苷酸的二聚体形成的悬突体的RNA链、与在序列号6表示的RNA的互补链的3’末端具有由胸苷核苷酸的二聚体形成的悬突体的RNA链进行配对得到的双链siRNA。RBM8A_siRNA⑴使在序列号7表示的RNA的3’末端具有由胸苷核苷酸的二聚体形成的悬突体的RNA链、与在序列号7表示的RNA的互补链的3’末端具有由胸苷核苷酸的二聚体形成的悬突体的RNA链进行配对得到的双链siRNA (Invitrogen公司制，商品编码 “HSS115051”)。RBM8A_siRNA⑵使在序列号8表示的RNA的3’末端具有由胸苷核苷酸的二聚体形成的悬突体的RNA链、与在序列号8表示的RNA的互补链的3’末端具有由胸苷核苷酸的二聚体形成的悬突体的RNA链进行配对得到的双链siRNA (Invitrogen公司制，商品编码 “HSS115052”)。RBM8A_siRNA(3)使在序列号9表示的RNA的3’末端具有由胸苷核苷酸的二聚体形成的悬突体的RNA链、与在序列号9表示的RNA的互补链的3’末端具有由胸苷核苷酸的二聚体形成的悬突体的RNA链进行配对得到的双链siRNA (Invitrogen公司制，商品编码 “HSS115053”)。另外，作为抑制Magoh的双链siRNA，使用下述2种物质。Magoh-siRNA(l)使在序列号10表示的RNA的3’末端具有由胸苷核苷酸的二聚体形成的悬突体的RNA链、与在序列号10表示的RNA的互补链的3’末端具有由胸苷核苷酸的二聚体形成的悬突体的RNA链进行配对得到的双链siRNAanvitrogen公司制，商品编码“HSS142861”)。Magoh-siRNA(2)使在序列号11表示的RNA的3’末端具有由胸苷核苷酸的二聚体形成的悬突体的RNA链、与在序列号11表示的RNA的互补链的3’末端具有由胸苷核苷酸的二聚体形成的悬突体的RNA链进行配对得到的双链siRNAanvitrogen公司制，商品编码“HSS142862”)。另外，作为对照的双链siRNA，使用下述5种物质。对照-siRNA(L):"Stealth(注册商标)RNAi Negative Control Low GC Duplex，，(商品名，Invitrogen 公司制)对照-siRNA(M):"Stealth(注册商标)RNAi Negative Control Med GC Duplex，，(商品名，Invitrogen 公司制)对照-siRNA(H):"Stealth(注册商标)RNAi Negative Control Hi GC Duplex，，(商品名，Invitrogen 公司制)对照-siRNA(SNC2) =Takara Bio 公司制，商品编码"SNC2，，对照-siRNA(SNC5) =Takara Bio 公司制，商品编码"SNC5，，<实施例1 ；细胞内的RBM8A的局部存在部位的确认>在确认RBM8A的细胞内的局部存在部位时，使用A549细胞，所述A549细胞在添加了 10%胎牛血清的 Dulbecco 改进的 eagle 的培养基(Dulbecco' s Modified Eagle，s Medium)中、于37°C下培养16小时。培养后的A549细胞用磷酸缓冲生理盐水(PBQ清洗 3次后，用4%低聚甲醛溶液或冷却至_20°C的甲醇固定。经固定的A549细胞使用0. 2%的 Triton(注册商标)XlOO溶液进行处理，用PBS洗涤，用牛血清白蛋白(BSA)溶液封闭。 之后，使用抗RBM8A小鼠或兔抗体、抗α-微管蛋白大鼠抗体、抗Y-微管蛋白兔或小鼠抗体、抗磷酸化AuroraB兔抗体、抗Magoh山羊抗体或抗FLAG肽小鼠抗体作为一次抗体，稀释抗体溶液，处理封闭后的A549细胞。接下来，使用抗兔IgG抗体及/或抗大鼠IgG抗体作为二次抗体，将RBM8A、或RBM8A和各种细胞内小器官染色。在染色后的培养细胞中添加4’， 6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对比染色后，使用“!Oolong Gold antifade Reagents，，(商品名，封入剂、^witrogen公司制)进行封入。对于封入后的试样，使用“LSM710”或 "Axiovert 200M”(均为商品名，荧光显微镜、Carl Zeiss公司制)，确认到RBM8A及各细胞内小器官的局部存在。将单独对RBM8A进行了抗体染色的荧光显微镜图像示于图1，将对RBM8A和Y-微管蛋白进行了二重染色的荧光显微镜图像示于图2。如图1所示，RBM8A的染色图案和DAPI的染色图案重复，可知RBM8A在间期的细胞中局部存在于核内。另外，在M期的细胞中，显示与纺锤体同样的局部存在图案的局部存在，暗示了 RBM8A和纺锤丝的相互作用。进而，如图2所示，RBM8A特别在M期与微管蛋白共同局部存在，表示RBM8A局部存在于纺锤体内。<实施例2 ；利用双链siRNA的RBM8A的表达抑制1>将RBM8A-siRNA (IG-B)或对照-siRNA (L)转染到A549细胞中，所述A549细胞在添加了 10%胎牛血清的 Dulbecco，s Modified Eagle，s Medium 中、于 37°C下培养 16 小时，进而进行胰蛋白酶处理回收细胞。使用低渗溶液使细胞膨润后，用卡诺液固定。将细胞的悬浮液滴到载玻片上使其干燥后，使用吉姆萨染色液进行染色。在光学显微镜下测定形成染色体的细胞的比例。结果示于图3。根据图3，在转染了 RBM8A-siRNA(IG-B)的细胞中，与转染了对照-siRNA(L)的细胞相比，观察到染色体聚集的细胞的比例明显较多。由此表明通过RBM8A的表达抑制，细胞在M期集聚。<实施例3 ；利用双链siRNA的RBM8A的表达抑制2>与实施例2同样地，分别将RBM8A-siRNA(l) (3)、对照-siRNA(L)、(M)转染到 A549细胞中，与实施例1同样地使用抗磷酸化组蛋白H3抗体(抗P-H3抗体)进行免疫染色。染色后的荧光显微镜图像如图4所示。另外，用抗磷酸化组蛋白H3抗体染色的细胞(M 期的细胞)相对于用DAPI染色的细胞的比例(％ )如图5所示。进而，测定转染了各双链 siRNA的细胞中的RBM8A的表达量的结果示于图6。由图4 图6可知，在转染RBM8A-siRNA(l) (3)、抑制了 RBM8A的表达的细胞中，与转染了对照-siRNA(L)、(M)的细胞相比，使用抗磷酸化组蛋白H3抗体染色的细胞的数量明显较多。由该结果暗示通过RBM8A的表达抑制，细胞在M期集聚。<实施例4 ；利用双链siRNA的RBM8A的表达抑制3>与实施例2同样地，将RBM8A_siRNA⑵或对照-siRNA (L)转染到Hela细胞中，利用双胸苷阻断法使Hela细胞的细胞周期在G1/S期停止，之后开放。用流式细胞仪“FACS Calibur"(商品名，Becton-Dickenson公司制)测定在细胞周期中通过G2/M期再次变为 Gl期的细胞的比例。结果示于图7。由图7可知，在转染了 RBM8A-siRNAQ)的细胞中，与转染了对照-siRNA(L)的细胞相比，在M期移行后再次发展至Gl期的细胞的比例明显较少。由该结果可知，在转染了 RBM8A-siRNA (2)的细胞中，有细胞周期在M期停止的倾向。另外，用相差显微镜观察转染了 RBMSA-siRNA(2)或对照-siRNA(L)的细胞时的显微镜图像如图8所示。由图8可知，在转染了 RBMSA-siRNAO)的细胞中，与转染了对照-SiRNA(L)的细胞相比，诱导了凋亡的细胞即浮游细胞的比例明显较多。<实施例5 ；利用双链siRNA的RBM8A的表达抑制4>与实施例2同样地，将RBM8A-siRNA(2)转染到A549细胞中，之后进行胰蛋白酶处理，之后对于回收的细胞，与实施例1同样地将Y-微管蛋白染色。在荧光显微镜下确认到微管蛋白的局部存在。利用抗Y-微管蛋白抗体的抗体染色图像示于图9。需要说明的是，图9中，白色箭头是显示异常的微管形态的细胞。使用RBM8A_siRNA(l) (3)、对照-siRNA(M)、(H)同样地将Y-微管蛋白染色， 在荧光显微镜下确认到微管蛋白的局部存在。在荧光显微镜下观察到的显示异常的微管形态的细胞的比例(％)示于图10。由图9、图10可知，在通过RBM8A-siRNA(l) (3)抑制了 RBM8A的表达的细胞中， 观察到许多微管的形态变得异常。<实施例6 ；利用双链siRNA诱导凋亡>将A549 细胞在添加了 10%胎牛血清的 Dulbecco，s Modified Eagle，s Medium 中、于37°C下培养48小时，胰蛋白酶处理并回收后，以单个细胞的形式接种到培养板上。向其中分别转染 RBM8A-siRNA(l) (3)、对照-siRNA(L)、(M)、(H)，使用 “Apo-one Caspase-Glo 3/7 assey”(商品名，凋亡检测试剂盒，Promega公司制)经时检测胱天蛋白酶3、7的活性。表示各细胞中的胱天蛋白酶3/7的活性量的荧光强度示于图11。由图11可知，对于转染了 RBM8A_siRNA(l) (3)的细胞，与转染了对照-SiRNA(L)、(M)、(H)的细胞相比，胱天蛋白酶3/7的活性较高。由该结果可知，在转染了 RBM8A-siRNA(l) ⑶的细胞中，有诱导凋亡的倾向。<实施例7 ；利用双链siRNA的RBM8A的表达抑制5>与实施例2 同样地分别将 RBM8A-siRNA (IG-B)、(IG-F)、对照-siRNA (SNC2)、 (SNC5)转染到A549细胞中，之后进行胰蛋白酶处理并回收，之后以单个细胞的形式接种在培养板上。测定各试样中的RBM8A的表达量的结果示于图12。另外，培养2周后，用PBS洗涤细胞，用甲醇固定，用吉姆萨染色液染色，结果示于图13。由图12、图 13 发现在转染了 RBM8A-siRNA(IG-B)、(IG-F)、抑制了 RBM8A 的表达的细胞中，活细胞减少。该结果暗示通过RBM8A的表达抑制来诱导凋亡。<实施例8 ；利用双链siRNA的Magoh的表达抑制1>与实施例2同样地，分别将Magoh-s iRNA⑴、(2)、对照_s iRNA (M)、(H)转染到 A549细胞中，之后进行胰蛋白酶处理，回收细胞。测定各试样的RBM8A及Magoh的表达量的结果示于图14。另外，使用流式细胞仪“FACS Calibur”(商品名，Becton-Dickenson公司制)分析细胞周期的结果示于图15。由图14可知，在转染了 Magoh-siRNA(l)、(2)的细胞中，不仅抑制了 Magoh的表达，也抑制了 RBM8A的表达。另外，由图15可知，对于转染了 Magoh-SiRNA(I)、⑵的细胞，与转染了对照-siRNA(M)、(H)的细胞相比，集中在图表的低值处。由该结果表明，通过 Magoh的表达抑制也抑制了 RBM8A的表达，诱导凋亡。产业上的可利用性本发明的抗癌剂能够特异性抑制序列号1表示的RBM8A、或序列号3表示的Magoh 的表达。其中，通过抑制癌细胞中的RBM8A或Magoh的表达及/或功能，能够使细胞周期在 M期停止，抑制细胞的增殖，因此，能够抑制癌细胞的增殖，同时诱导癌细胞的凋亡，能够治愈癌。
权利要求
1.一种抗癌剂，含有特异性抑制序列号1表示的蛋白质或其同种型的表达及/或功能的化合物。
2.如权利要求1所述的抗癌剂，其中，所述化合物为特异性抑制序列号1表示的蛋白质或其同种型的表达的双链siRNA，构成所述双链siRNA的RNA分子的至少一方能够与序列号2表示的mRNA互补结合。
3.一种抗癌剂，含有特异性抑制序列号3表示的蛋白质或其同种型的表达及/或功能的化合物。
4.如权利要求3所述的抗癌剂，其中，所述化合物是特异性抑制序列号3表示的蛋白质或其同种型的表达的双链siRNA，构成所述双链siRNA的RNA分子的至少一方能够与序列号4表示的mRNA互补结合。
5.如权利要求1 4中任一项所述的抗癌剂，用于非小细胞肺癌或乳癌的治疗。
6.一种药物组合物，以权利要求1 5中任一项所述的抗癌剂作为有效成分。
7.一种癌细胞的凋亡诱导方法，使用权利要求1 5中任一项所述的抗癌剂。
8.一种抗癌剂的筛选方法，包括下述步骤使分离的癌细胞与候补物质接触的步骤；在所述癌细胞中，检测序列号1或3表示的蛋白质或它们的同种型的表达及/或功能的步骤；及从所述候补物质中选择使序列号1或3表示的蛋白质或它们的同种型的表达及/或功能下降的候补物质的步骤。
9.如权利要求8所述的抗癌剂的筛选方法，其中，在检测序列号1或3表示的蛋白质或它们的同种型的表达及/或功能的所述步骤中，检测序列号1或3表示的所述蛋白质、及在机体内与序列号1或3表示的所述蛋白质相互作用的其他蛋白质的相互作用或复合体形成，在从所述候补物质中选择使序列号1或3表示的蛋白质或它们的同种型的表达及/或功能下降的候补物质的所述步骤中，选择使序列号1或3表示的所述蛋白质与所述其它蛋白质的相互作用或复合体形成下降的候补物质。
10.如权利要求8所述的抗癌剂的筛选方法，其中，在检测序列号1或3表示的蛋白质或它们的同种型的表达及/或功能的所述步骤中，测定表达序列号2或4表示的mRNA的基因的表达量，在从所述候补物质中选择使序列号1或3表示的蛋白质或它们的同种型的表达及/或功能下降的候补物质的所述步骤中，选择使表达序列号2或4表示的mRNA的基因的表达量下降的候补物质。
11.如权利要求10所述的抗癌剂的筛选方法，其中，所述候补物质为具有3’悬突体的双链siRNA，构成所述双链siRNA的RNA分子的至少一方能够与序列号2或4表示的mRNA互补结口 O
12.如权利要求8 11中任一项所述的抗癌剂的筛选方法，其中，在使分离的癌细胞与候补物质接触的所述步骤中，在候补物质的存在下培养癌细胞。
13.如权利要求8 12中任一项所述的抗癌剂的筛选方法，其中，在检测序列号1或3表示的蛋白质或它们的同种型的表达及/或功能的所述步骤中，使用针对序列号1或3表示的蛋白质的抗体，测定所述蛋白质的表达及/或功能。
全文摘要
本发明提供一种与紫杉烷类抗癌剂不同的、抑制细胞周期在M期发展的抗癌剂。本发明的抗癌剂含有下述化合物，所述化合物特异性抑制序列号1表示的RBM8A、序列号3表示的Magoh、或它们的同种型的表达及/或功能。其中，通过抑制癌细胞中的RBM8A或Magoh的表达及/或功能，能够使细胞周期在M期停止，抑制细胞的增殖，因此，能够抑制癌细胞的增殖，同时诱导癌细胞的凋亡，能够治愈癌。
文档编号A61K31/7088GK102470174SQ20108003197
公开日2012年5月23日 申请日期2010年7月14日 优先权日2009年7月15日
发明者友杉直久, 石垣靖人 申请人:Mcp生物技术株式会社