一种诱导肿瘤细胞凋亡的方法

文档序号:9533667阅读:908来源:国知局
一种诱导肿瘤细胞凋亡的方法
【技术领域】:
[0001] 本发明属于药物治疗肿瘤技术领域,涉及化合物与天然产物联合用药的效果测评 方法,具体涉及一种利用ERK信号通路抑制剂与齐墩果酸联合给药诱导肿瘤细胞凋亡的方 法。
【背景技术】:
[0002] 齐墩果酸((3 β ) -3-Hydroxyolean-12-稀-28-酸,也简称为0A),天然五环三砲, 广泛分布于各种水果、蔬菜和药材中,并具有多种生物活性。齐墩果酸已知的生物活性包括 抗肿瘤,抗炎,抗高血糖,抗病毒和肝脏保护作用,而且齐墩果酸对正常细胞和组织没有显 著的细胞毒作用,由于其各种生物活性和极小的细胞毒作用,齐墩果酸一直备受科学家们 的关注,齐墩果酸的合成及其衍生物的合成也成为研究热点。大量证据表明,在肿瘤细胞中 齐墩果酸主要通过诱导凋亡途径发挥其抗肿瘤活性,然而最近的研究表明,齐墩果酸处理 的肿瘤细胞中,ERK信号通路被激活,从而引起下游信号通路中的的抗凋亡蛋白表达,降低 了齐墩果酸的抗肿瘤活性。但是,利用ERK信号通路抑制剂与齐墩果酸联合作用诱导肿瘤 细胞凋亡的技术尚未见有公开报道。

【发明内容】

[0003] 本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点,寻求设计一种采用EPK信号通路抑 制剂与齐墩果酸联合给药诱导肿瘤细胞凋亡的方法,鉴于细胞凋亡的发生过程,活性氧的 产生是齐墩果酸促凋亡活性的决定性因素,ERK的通路是细胞中一个关键的消除活性氧的 信号通路,将ERK信号通路抑制剂与齐墩果酸联合使用,促进活性氧的产生,增强齐墩果酸 诱导凋亡的能力和抗肿瘤作用。
[0004] 为了实现上述目的,本发明涉及的具体工艺步骤包括:
[0005] (1)肿瘤细胞培养:选用购自美国典型培养物保藏中心(Manassas,VA)肺腺癌 A549和PANC-1胰腺癌细胞,将肺腺癌A549和PANC-1胰腺癌细胞在胎牛血清体积比为10 % (英潍捷基公司)的RPMI1640肿瘤细胞培养基(Gibco)中,在C02体积百分比为5%的湿 润37°C条件下进行培养;
[0006] ⑵化学试剂和小干扰RNA的获得:齐墩果酸购自SigmaAldrich公司(货 号05504) ;ERK抑制剂U0126购自细胞信号技术公司(货号#9903);靶向ERK的小干 扰RNA(siERK,货号#6560,10微摩尔/毫升)以及对应的对照小干扰RNA(货号#6568) 均购自细胞信号技术公司;小干扰RNA转染试剂为英潍捷基公司的L i pof ec t am i n e? RNAiMAX(货号13778);所有的工作液均需要在使用时现场配置,使用步骤(1)中的肿瘤细 胞培养基将齐墩果酸稀释至终浓度为200微克/毫升得到齐墩果酸工作液;使用步骤(1) 中的肿瘤细胞培养基将ERK抑制剂U0126稀释至终浓度为10微摩尔/毫升得到U0126工 作液;将3微升小干扰RNA母液加入150微升Opti-MEM培养基,同时再将9微升小干扰RNA 转染试剂加入150微升Opti-MEM培养基,将两者混合后室温环境下放置5分钟得到小干扰 RNA工作液;
[0007] (3)齐墩果酸联合ERK通路抑制剂:齐墩果酸联合ERK通路抑制剂包括齐墩果酸 联合U0126和齐墩果酸联合ERK小干扰RNA两种方案,其中齐墩果酸联合U0126方案是按照 步骤⑴的条件培养肿瘤细胞24小时后,弃去肿瘤细胞培养基,加入步骤⑵中的U0126工 作液,1小时后,加入与U0126工作液等体积的齐墩果酸工作液,36小时后,按照步骤(4)的 方法检测细胞凋亡情况;齐墩果酸联合ERK小干扰RNA是按照步骤(1)的条件将0. 25 X 106个肿瘤细胞在6孔板中培养24小时后,弃去肿瘤细胞培养基,加入步骤(2)中的小干扰RNA 工作液;6小时后弃去培养基,再次加入步骤(1)的肿瘤细胞培养基,36小时后,加入与小干 扰RNA工作液等体积的齐墩果酸工作液,36小时后,按照步骤(4)的方法检测细胞凋亡情 况;
[0008] (4)细胞凋亡状况检测:采用免疫印迹法检测细胞凋亡状况时,使用M-PER哺乳动 物蛋白提取试剂(热电科学公司)从细胞中提取总蛋白,在重量百分比浓度为10-12%的 SDS-PAGE上分离,然后转移到0. 45微米孔径的硝酸纤维素膜上;再将所得的膜使用重量百 分比浓度5%的BSA孵育1小时,然后使用一抗在湿润的4°C条件下孵育12-16小时;最后 用二抗识别结合的一抗,以 SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate (热 电科学公司)作为底物对目标蛋白质的条带显影;所述的一抗和二抗均为细胞信号技术公 司,包括:cleaved PARP,货号 #5625;cleaved caspase-3,货号 #9664;0_tubulin,货号 #2146 ;辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔免疫球蛋白G,货号#7074 ;辣根过氧化物酶偶联的 马抗小鼠免疫球蛋白G,货号#7076 ;采用流式细胞方法检测细胞凋亡状况时,先进行流式 细胞术分析,确定凋亡细胞的百分比,具体方法为加入质量百分比浓度为70%乙醇水溶液 放置1小时,10毫克/毫升RNA酶A在37°C消化1小时,然后使用浓度为200毫克/毫升 碘化丙啶(PI)染色,最后通过流式细胞术分析(AriaII,BD Biosciences公司),每个样品 进行1 X 105个细胞计数,得到凋亡细胞的数目和比例;其检测结果显示,抑制ERK途径能够 增强齐墩果酸的抗肿瘤活性,促进肿瘤细胞凋亡将齐墩果酸联合ERK抑制剂用药,显著增 加肿瘤细胞的凋亡水平;在A549肺癌细胞中,齐墩果酸联合U0126使细胞凋亡率上升50 %; 齐墩果酸联合小干扰RNA使细胞凋亡率上升25 % ;在PANC-1细胞中,齐墩果酸联合U0126 使细胞凋亡率上升25 % ;齐墩果酸联合小干扰RNA使细胞凋亡率上升30 %。
[0009] 本发明与现有技术相比,其选择的工艺路线合理,用药组合科学,诱导凋亡的条件 易实现,效果明显,测定技术工艺成熟,应用前景良好。
【附图说明】:
[0010] 图1为本发明实施例1和2诱导凋亡的效果图,其中A为A549使用齐墩果酸联合 U0126用药后,使用免疫印迹法检测肿瘤细胞凋亡水平;B为A549使用齐墩果酸联合U0126 用药后,使用流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡水平;C为A549使用齐墩果酸联合小干扰RNA 用药后,使用免疫印迹法检测肿瘤细胞凋亡水平;D为A549使用齐墩果酸联合小干扰RNA 用药后,使用流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡水平。
[0011] 图2为本发明实施例3和4诱导凋亡的效果图,其中A为PANC-1使用齐墩果酸联 合U0126用药后,使用免疫印迹法检测肿瘤细胞凋亡水平;B为PANC-1使用齐墩果酸联合 U0126用药后,使用流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡水平;C为PANC-1使用齐墩果酸联合小干 扰RNA用药后,使用免疫印迹法检测肿瘤细胞凋亡水平;D为PANC-1使用齐墩果酸联合
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