用于诱导癌细胞凋亡的蛋白质及其分离方法

专利名称：用于诱导癌细胞凋亡的蛋白质及其分离方法
技术领域：
本发明
背景技术：
长期以来，人类与癌症一直在做着不懈的斗争。因为该疾病是如此普遍，并以各种方式无情地图害着人类的生命，因此有效的癌症治疗方法的潜在市场是巨大的。估计有一千万以上的美国人患有或者患过癌症。美国国家肿瘤研究所(NCI)预计在1995年，美国大约有120万患者将患有癌症，并且有538,000人将死于这种疾病。
今天，尽管结合了外科手术，化学疗法，及发射性疗法，癌症的治愈率还是很低的。化学疗法的低成功率原因在于当前的化学疗法是以迅速分化的肿瘤细胞为靶子的。这种方法对潜伏的或者生长缓慢的癌细胞是低效率的。这种疗法还影响迅速分化的正常细胞，引起有害的副作用。
最近几年才出现了一种治疗癌症的新方法，该方法以最近刚被发现的生物学现象“细胞凋亡”为基础，细胞凋亡又被称为“细胞的程序化死亡”或者“细胞自杀”(Tomei等人，“细胞凋亡”细胞死亡的分子基础。冷泉港实验室出版社，1991)。与细胞损伤导致的细胞死亡相比，细胞凋亡是基因介导的细胞主动自毁过程并且为生物学上有意义的功能服务(Kerr,J.F.R and J.Searle J.Pathol.107:41 1971)。细胞凋亡在生物学上有意义的功能实例之一是胚胎的形态形成(Michaelson,J.Biol.Rev.62:115,1987)，就象需要增加或者减少泥土的塑像雕刻过程一样，胚胎的器官形成(形态形成)依赖于细胞的生长(增添泥土)以及细胞的死亡(减少泥土)。从胚胎形成的早期阶段到无法避免的衰老阶段细胞凋亡都在人体内起着关键的作用，(Wyllie,A.H.Int.Rev.Cytol.68:251,1980)。免疫系统、胃肠系统和造血系统的正常功能依赖于细胞凋亡的正常作用。当细胞凋亡的功能不正常时就会导致这样或者那样的一些疾病产生，如癌症、病毒感染、自身免疫疾病/过敏反应、神经抑制以及心血管疾病。因为在人类疾病中所涉及的细胞凋亡的多功能性，“细胞凋亡”正在变成药物研究领域中的一个突出的行业用语。人们已将大量的时间和金钱用在其作用机理的研究上，研究它是怎样被抑制或者被激发的，并且将这种机理应用于药物学的研究应用上。已经成立了这样一些公司，其致力于在该新生领域开发出有市场竞争力的产品，这样一些有创意的新生力量的出现结合一些有实力的大公司的尝试性的行动使得细胞凋亡--这个二十世纪九十年代发展最为迅猛，最有发展潜力之一的药物学领域的研究成为可能。
最近有这样一种观点认为，癌症是由不充分的细胞凋亡引起的(Cope,F.O and Wille,J.j,“Apoptosis”:The molecular Basis of CellDeath，冷泉港实验室出版社，pp61,1991)。这种观点为癌症治疗开创了一种新的思路---癌细胞可以通过激励细胞凋亡被杀死。以正常发展中的诸过程为基础，细胞凋亡的调谐作用是一种控制肿瘤细胞增殖的潜在机制。恢复肿瘤细胞中的细胞凋亡机制是一种值得尝试的方法，因为至少在理论上它将导致细胞自杀死亡。然而，癌症的治疗目的在于杀死癌细胞而不损害宿主细胞，尽管细胞凋亡机制在癌细胞中诱导细胞凋亡为癌症治疗开辟了一条新的途径，但是成功的治疗仍然依赖于能够有选择地在癌细胞中诱导细胞死亡而不损害正常细胞的药剂的可用性。在这份专利申请中，我们介绍一些蛋白质的分离方法，这些蛋白质在癌细胞中逐一地诱导细胞凋亡但不损害正常细胞。这些蛋白质可以提供一类新抗癌药物，它们将在癌细胞中诱导细胞凋亡，从而为癌症治疗提供一个突破口。
本发明的详细描述这项专利申请介绍下述五种蛋白质的分离方法Apogen P-1a、Apogen 1b、Apogen 1c、Apogen P-2和Apogen L。
(A)Apogen P-1的分离(1)Apogen P-1来源Apogen P-1是从一种名为XC的细胞系的条件培养基中分离出来的，这种XC细胞来源于鼠肿瘤并且可以从美国典型培养基收集中心(ATCC)购买。首先，让XC细胞在含有10％牛胎血清(FBS)的DMEM培养基中生长三天。然后，用PBS(3×100ml)清洗XC细胞以除去血清，再让XC细胞在不含FBS的DMEM中培养4天。在此不含血清的条件培养基中，我们检测到一种在前列腺癌细胞系(LNCAP)中诱导细胞凋亡的活性。然而，正常的人肺纤维源细胞系(CCD39Lu)与乳癌细胞(MCF-7)不受该活性影响。
(2)Apogen P-1的活性(a)凋亡诱导活性XC细胞的天然的条件培养基的活性是在下述细胞系中进行检测的JEG-3(绒毛膜癌)、G401(Wilm’s肿瘤)、LNCAP(前列腺癌)、T84(结肠癌)、HL-60(白血病)、乳癌细胞(MCF-7)和CCD39Lu(正常肺纤维源细胞)。当被浓缩10倍的条件培养基与上述细胞系一起在有5％血清存在的条件下培养18小时时，该条件培养基在JEG-3细胞(35％)、G401细胞(27％)和LNCAP(100％)中诱导细胞凋亡，而在CCD39Lu(0％)、T84(0％)、MCF-7(0％)和HL-60(0％)中没有活性。
细胞凋亡是一种截然不同的细胞死亡类型，就其自然和生物学意义而言它完全不同于衰退死亡或者坏死。正在经历凋亡的细胞在形态学及生物化学上与正在经历坏死的细胞有显著的区别。在形态学上，在细胞凋亡中用电子显微镜检测到的早期的显著变化是核染色体在细胞核膜附近被压缩为急剧缠绕的均一的浓缩体及细胞质的浓缩体。用相差显微镜观察细胞凋亡显示了DNA从浓缩到分裂及细胞从产生到凋亡的整个过程。
为了从形态学上证明XC条件培养基含有诱导细胞凋亡的活性成份，LNCAP细胞被培养于对照培养基与条件培养基中各15小时，然后用Hoechst染剂染色2小时，如

图1A所示，用对照培养基培养的LNCAP细胞核正常(A)。然而用RPMI培养基替换X20培养基却发现LNCAP细胞核出现了细胞凋亡的特征(图1(B))。首先，与图1(A)中的对照核相比较萤光强度更高，这表明条件培养基可导致核质的浓缩。其次，图1(B)所示的核质破碎可以证明核质浓缩的同时也出现了DNA的破碎。正象我们在前面陈述的那样，核质浓缩与DNA破碎是细胞凋亡的形态学特征。这些结果说明来自XC细胞的条件培养基含有诱导LNCAP细胞凋亡的活性成份。然而，在人肺纤维源细胞(CCD39Lu细胞)和乳癌细胞(MCF-7)中，这些条件培养基则不能诱导细胞凋亡。如图2所示，CCD39Lu的细胞核不论是否用XC细胞条件培养基培养都是一样的(图2(A)和图2(B))。
(b)细胞拒斥活性最近发现如下所述分离的部分纯化的Apogen P-1b(Q2阴离子交换色谱法)含有除诱导细胞凋亡以外的其他活性成份。我们发现Apogen P-1b具有拒斥细胞的活性。这种活性与生长因子的活性截然相反；许多生长因子(如血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、纤维源细胞生长因子(FOF)或转化生长因子(TOF))作为“化学吸引剂”起作用，这意味着这些生长因子吸引细胞朝它们靠拢(Grotendorst,O.R.等人，Proc.NatI.Acad.Sci.78,3669,1981,Grant,M.B.等人，Invest.Ophthal.Visual Science.33,3292,1992)。这些发现意味着按本发明分离的Apogen P-1b起到与生长因子截然相反的作用。例如，生长因子诱导细胞生长和吸引细胞，而Apogen P-1b诱导细胞死亡和拒斥细胞。Apogen P-1b是现代生物学领域最先发现的“化学拒斥剂”。
一种购自Costar(Cambridge,MA)的称为Transwell Insert的组织培养装置可以用来揭示化学拒斥剂Apogen P-1b的活性。这种已被广泛用于研究细胞迁移或细胞侵入的装置包含一个上仓和一个底仓。在这两个仓室之间是孔径为3.0um允许细胞穿过的多微孔聚酯膜。被测试的细胞在上仓生长，而被测试的化合物放在下仓中。如果被测试的化合物是化学吸引剂的话，我们应当看到比对照样品多的细胞穿过膜。在我们的实验中，细胞大小是膜孔径3-4倍的Hep02细胞(100,000细胞)在上仓中培养2小时，然后将通过上述的硫化铵沉淀和Q2 HPLC色谱法分离的部分纯化的Apogen-1b(30μl)置于下仓中。15小时以后，用0.2ML胰岛素溶液处理膜30分钟并收集通过该薄膜的细胞。用血球记数器数出10微升胰岛素溶液中的细胞数。重复几次实验后，我们发现部分纯化的Apogen-1b含有一种活性成份，该成分降低通过膜的细胞数量。例如，在一个有部分纯化的Apogen-1b存在的实验中，10微升胰岛素溶液中的细胞数目(通过膜的细胞数量)是24+-4，而在对比实验中通过该薄膜的细胞数是82+-27。这个结果意味着部分纯化的Apogen-1b阻止Hep G2细胞通过膜。为了清楚地证明Apogen P-1b拒斥细胞的特性，我们接着做了一个反向实验，把Apogen P-1b由下仓转移到上仓，实施同样的步骤，12小时后，发现每10微升胰岛素溶液中有56+-19个细胞通过膜，而对照实验有30+-1.7个细胞通过膜。通过交替地把Apogen P-1b放在这种组织培养装置的上仓或下仓中，统计通过该薄膜的细胞数量的增减，从而清楚地证明Apogen P-1b拒斥细胞的特性。
(3)从XC条件培养基中分离Apogen P-1在条件培养基中存在的Apogen P-1可以通过下列步骤进行分离步骤1硫化铵沉淀通过在每升条件培养基中加入561克硫化铵使Apogen P-1在80％饱和度的硫化铵中沉降。通过离心收集沉淀的蛋白质小球，并将它们溶解在10mM的Tris-HCl(pH7.4)中。在通过透析除去硫化铵之后，用Q2 HPLC色谱柱分离溶解的蛋白质。
步骤2Q2 HPLC色谱法用硫化铵沉淀法分离的蛋白质经溶解和浓缩后被加载到Q2柱(BiO-Rad)上，然后利用伯乐生物技术公司HPLC色谱系统通过A缓冲液(10mM Tris-HCl,pH7.4)和B缓冲液(10mM Tris-HCl,pH7.4,0.55M NaCl)所构建的线性梯度被进一步展开。该线性梯度是通过在10分钟内使B缓冲液在A缓冲液中从0％逐步增加到100％来构建的(20毫升的洗脱体积)，然后用100％B缓冲液将该色谱柱洗脱5分钟。色谱图如图3所示。
Apogen P-1的活性可以通过在LNCAP细胞中诱导细胞凋亡进行检验。在色谱图谱上有三个活性高峰。在18小时内，级份5-7可以导致70％细胞死亡，级份8-10可以导致65％细胞死亡，级份11-14可以导致90％细胞死亡。我们收集到级份5-7并将其命名为ApogenP-1a，级份8-10被命名为Apogen P-1b，级份11-14被命名为ApogenP-1c。这三种Apogen P-1通过反相柱被进一步纯化。
步骤3反相色谱法Apogen P-1a、Apogen P-1b和Apogen P-1c分别被浓缩到1.5毫升。在每个样中加入1ml含有0.05％的三氟乙酸的甲醇溶液，通过这种处理，大量的蛋白质被沉降下来，而诱导细胞凋亡的活性成份则保留在上清液中。然后，将上清液应用于RP4反相色谱柱(MicroScientific Inc)，并且通过溶液A(H20,0.05％TFA)和溶液B(Methanol,0.05％TFA)构建的线性梯度展开。该线性梯度是通过在10分钟内使B溶液在A缓冲液中逐步从0％增加到100％构建的(20毫升洗脱体积并且用100％的溶液B将该色谱柱洗脱5分钟)。
步骤4制备电泳用阴离子交换色谱分离得到的Apogen 1c借助反相色谱法(步骤3)及制备电泳(BIO--RED公司的MiniPrep Gel电泳仪)进行纯化。Apogen P-1a的反相色谱图如图4(a)所示。级份12-13具有能在10小时内诱导80％的LNCAP细胞死亡的活性。Apogen P-1b的反相色谱图如图4(b)所示。级份14和15具有能在18小时内诱导45％的LNCAP细胞死亡的活性。Apogen P-1c的反相色谱图如图4(c)所示。级份5具有在18小时内诱导52％的LNCAP细胞死亡的活性。
分离的Apogen P-1a、Apogen P-1b和Apogen P-1c的纯度可以用镀银染色的SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDSPAGE)进行检测。
(1)Apogen P-1a如图5所示，所获得的是分子量为70KD的多肽链。这个结果表明在SDSPAGE上分子量为70KD的ApogenP-1a几乎被成功的纯化。
(2)Apogen P-1b所获得的是分子量为55KD的多肽链，这个结果表明在SDSPAGE上分子量为55KD的Apogen P-1b被成功的纯化(无数据显示)。
(3)Apogen P-1c通过用反相色谱法纯化到的Apogen 1c具有70KD分子量的蛋白质链分离而用制备电泳法得到57KD分子量的蛋白质链。如图6(A)所示，一主要蛋白质链是经反相色谱法纯化到的具有70KD分子量的蛋白质链，而用预电泳法得到57KD分子量的蛋白质链(图6B)。
我们的下一步工作是将我们的全部努力致力于获取足够的具一定氨基酸序列的蛋白质链。(B)Apogen P-2的分离(1)Apogen P-2的来源Apogen P-2是从被称为C3H 1OT1/2的细胞系的条件培养基中分离出来的。这种细胞起源于鼠胚胎细胞，购买于美国典型培养物收集中心(ATCC)。C3H 1OT1/2细胞首先于含有10％牛胎血清(FBS)的Eagle的培养基(alpha-MEM)中培养三天。然后用PBS(3×100ml)洗涤细胞以去除血清，然后在不含FBS的alpha-MEM中培养4天。我们从这种不含血清的条件培养基中检测到在前列腺癌细胞系(LNCAP)中诱导细胞凋亡的活性。然而正常的人肺纤维源细胞系(CCD39Lu)却不受这种活性的影响。
(2)Apogen P-2的活性(a)诱导细胞凋亡的活性C3H 1OT1/2细胞的天然条件培养基的活性可以基于下列细胞系进行检测LNCAP(前列腺癌细胞)，乳癌细胞(MCF-7)，及CCD39Lu(正常的人肺纤维源细胞)。当10倍浓缩的条件培养基与上述细胞一起在有5％血清存在的条件下培养18小时后，该条件培养基将在LNCAP中诱导细胞凋亡(100％)，但是在CCD39Lu中却没有此活性(0％)。为了从形态学上证明C3H IOT1/2条件培养基含有诱导细胞凋亡的活性，用对照培养基或经过上述处理的条件培养基将LNCAP细胞培养15小时，然后用Hoechst染料染色2小时。如图7A所示，用对照培养基培养的LNCAP细胞的细胞核是正常的(图7A)。但是，用条件培养基培养的LNCAP细胞的细胞核显示细胞凋亡的特征(图7B)。首先，条件培养基导致了细胞核浓缩，与图7A所示的对照细胞核比较萤光强度较强足以证明这一点。其次，核质浓缩伴随有DNA的破碎，图7B所示的核破碎将证明这一点。正如上所述，细胞核质浓缩与DNA破碎是凋亡状态下细胞的形态学特征。同样可以用乳癌细胞(MCF-7)证明这一点，它在P-2中暴露18小时后将观察到85％的细胞凋亡的效果。这些结果表明来自于C3H1OT1/2细胞的条件培养基含有在LNCAP及MCF-7细胞中诱导细胞凋亡的活性。另一方面，这种条件培养基在正常的人肺纤维源细胞(CCD39Lu细胞)中不诱导细胞凋亡。如图8所示，CCD39Lu细胞不管是否用C3HIOT1/2细胞的条件培养基培养都保持同样的特征(图8A和图8B)。
(b)细胞拒斥活性最近有人发现，借助硫化铵沉降、羟磷灰石及肝磷脂处理分离的部分纯化的Apogen P-2包含与诱导细胞凋亡截然不同的活性。与Apogen P-1b相似，Apogen P-2也具有拒斥细胞的活性。，购自Costar(Cambridge,MA)的Transwell Insert被用来检测Apogen P-2的化学拒斥剂活性。这种已被广泛地用于研究细胞迁移或细胞侵入的设备包含一个上仓和一个底仓。在这两个仓室之间是一个孔径为3.0μm允许细胞穿过的多微孔聚酯膜。要测试的细胞(HL-60)在上仓生长，待测试的混和物(Apogen P-2)放在下仓中。在我们的实验中，细胞大小是薄膜孔径2-3倍的HL-60细胞(100,000细胞)在上仓中培养2小时。然后用硫化铵沉淀，羟磷灰石及肝磷脂处理后，部分纯化ApogenP-2(301)放置于下仓中。6小时以后，收集通过微孔膜的细胞。然后再将下仓中的培养物(0.6ML)离心10分钟，收集通过膜的HL-60细胞，并且使这些细胞重新悬浮在80μl的PBS中。用血球记数器记数每10微升PBS溶液中的细胞数目。重复几次实验后，我们发现部分纯化的ApogenP-2中含有一种活性成份，其可以不断降低通过膜的细胞数量。例如，在有部分纯化的ApogenP-2存在时，每10微升PBS溶液中的细胞数目(通过膜的细胞数目)是47+-5.6，而在对比实验中通过微孔膜的细胞数目是213+-40。在这个瞬间，上仓中的HL-60细胞并未出现细胞凋亡的特征。这些结果证明部分纯化的ApogenP-2可以阻碍HL-60细胞通过膜。
(3)从C3H1OT1/2条件培养基中分离Apogen P-2存在于条件培养基中的Apogen P-2是通过如下步骤进行分离的步骤1硫化铵沉淀通过在每升条件培养基中加入561克硫化铵使Apogen P-2在80％饱和度的硫化铵中沉降，通过离心收集沉淀的蛋白质小球，并将它们溶解在10mM的Tris-HCl(pH7.4)中。
步骤2用羟磷灰石处理通过10mM Tris-HCl(pH7.5)透析分离除去硫化铵之后，将溶解的蛋白质在羟磷灰石凝胶(Bio-Gel HTP gel,Bio-Rad)中培养1小时。通过离心除去HTP凝胶后，人们发现在LNCAP细胞中诱导细胞凋亡的活性存在于上清液之中，然后用肝磷脂琼脂糖凝胶进一步处理该上清液。
步骤3肝磷脂琼脂糖处理将来自步骤2的上清液用肝磷脂琼脂糖(Sigma)进一步培养1小时。通过离心除去HTP凝胶后，在LNCAP细胞中诱导细胞凋亡的活性成份存在于上清液中。
步骤4反相色谱在步骤3中存在于肝磷脂琼脂糖的上清液中的Apogen P-2用反相色谱法进一步进行处理。Apogen P-2被浓缩至1毫升。加入1ml含有0.05％的三氟乙酸的甲醇溶液。通过这种处理，大多数的蛋白质被沉降，而诱导细胞凋亡的活性成份(P-2)保留在上清液中。然后，将该上清液应用于RP4反相色谱柱(Micra Scientific Inc.)并且借助溶液A(H2O,0.05％TFA)和溶液B(甲醇，0.05％TFA)构建的线性梯度展开。该线性梯度是通过在10分钟内使溶液A中的溶液B从0％逐步增加到100％构建的(20毫升洗脱体积并且用100％的溶液B将色谱柱洗脱5分钟)。
Apogen P-2的反相色谱图示于图9。级份12-14含有在LNCAP细胞中以12小时诱导80％的细胞死亡的活性成份。分离后ApogenP-2的纯度可以用镀银染色的SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳进行测定。所获得的是分子量为65Kd的单一的蛋白质链(图10)。(C)Apogen L的分离(1)Apogen L的来源Apogen L是从购自美国典型培养物收集中心(ATCC)的XC细胞系的条件培养基中分离出来的。XC细胞在含有10％牛胎血清(FBS)的Eagle培养基的Dulbecco改性物(DMEM)中培养四天。我们从这种条件培养基中检测到在名为HL-60的白血病细胞中诱导细胞凋亡的活性成份。另一方面，正常的人肺纤维源细胞(CCD39Lu)不受这种活性成份的影响。
(2)从XC条件培养基中分离Apogen L存在于XC条件培养基中的Apogen L可以通过下述步骤进行分离。
步骤1DE52吸收用阴离子交换剂DE52(二乙氨乙基纤维素，Whatman)将条件培养基培养1小时。然后，离心处理培养的混合物，收集束缚Apogen L的DE52，并且用含有0.15M NaCL的10mM Tris-HCL(pH7.5)洗涤。然后，用含有0.5M NaCl的10mM Tris-HCl(pH7.5)从DE52纤维素中将Apogen L洗涤出来。
步骤2肝磷脂琼脂糖吸收经步骤1分离的Apogen L通过用肝磷脂琼脂糖培养1小时进一步被肝磷脂琼脂糖(Sigma)吸收。借助离心收集肝磷脂琼脂糖，并且用10mM Tris-HCl(pH7.5)洗涤。然后，用2M NaCl洗提被肝磷脂琼脂糖吸收的Apogen L。
步骤3Q2 HPLC色谱法如上所述分离后的Apogen L进一步浓缩后被加载到Q2色谱柱(Bio-Rad)上，该色谱柱利用伯乐生物技术公司HPLC系统通过由A缓冲液(10mM Tris-HCL,pH7.4)和B缓冲液(10mM Tris-HCL,pH7.4.0.5M NaCL)构建的线性梯度进一步展开。该线性梯度是通过在10分钟内使B缓冲液在A缓冲液中从0％逐步增加到100％构建的。色谱图如图12所示。分离后的Apogen L的纯度可以用镀银染色的SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳进行测定。所获得的是分子量为55Kd的单一的蛋白质链(图11)。
(3)Apogen L的活性如上所述分离的Apogen L的活性是通过下列细胞系进行检验的HL-60(白血病)和CCD39Lu(正常的肺纤维源细胞)。为了从形态学上证明Apogen L含有诱导细胞凋亡的活性成份。如上分离的Apogen L与HL-60细胞一起培养15小时然后用Hoechst染剂染色2小时。如图13A所示，与对照培养基一起培养的HL-60细胞核是很正常的(图13A)。与Apogen L一起培养的HL-60细胞核呈现出细胞凋亡的特征(图13B)。首先，Apogen L导致细胞核浓缩，这通过与图13A所示的对照细胞核相比呈现更强萤光得以证实。其次，核质的浓缩伴随有DNA的破碎，这通过图13B所示的细胞核的破碎可以证明。正如上文所述，核质浓缩与DNA的破碎是细胞处于凋亡状态的两个形态学特征。这些结果无一不证明了Apogen L含有可以在HL-60细胞中诱导细胞凋亡的活性成份。Apogen L还在MCF-7(乳癌)细胞中诱导细胞凋亡。然而，该条件培养基不能在正常的人肺纤维源细胞(CCD39Lu细胞)中诱导细胞凋亡。
附图简要说明图1通过XC细胞的条件培养基在前列腺癌细胞(LNCAP)中诱导细胞凋亡。LNCAP细胞用对照培养基或条件培养基培养15小时，然后用Hoechst染剂染色两小时。如图1A所示，用对照培养基培养的LNCAP细胞核是正常的，而用条件培养基(X20,exchanged to RPMI)培养的LNCAP细胞核呈现细胞凋亡的特征(图1(B))。首先，条件培养基可以导致细胞核浓缩，这可以通过与图1(A)所示的对照细胞核相比呈现更强的萤光得以证实。其次，核质浓缩伴随有DNA的破碎，这可以通过图1(B)所示的细胞核破碎得以证实。正如上文所述，核质浓缩与DNA的破碎是细胞处于凋亡状态的两个形态学特征。这些结果无一不证明了来自于XC细胞的条件培养基含有在LNCAP细胞中诱导细胞凋亡的活性成份。
图2XC条件培养基在正常的人肺纤维源细胞(CCD39Lu)中不诱导细胞凋亡。CCD39Lu细胞用对照培养基或条件培养基培养15小时，然后用Hoechst染剂染色2小时(如图1)。细胞看上去是很正常的；不管是否用XC细胞条件培养基培养，CCD39Lu的细胞核都保持相同状态(图2(A)和图2(B))。这些结果证明了XC条件培养基不能在人正常肺纤维源细胞(CCD39Lu)中诱导细胞凋亡。
图3通过Q2阴离子交换色谱分离的Apogen P-1s。通过硫化铵沉淀分离后被溶解的蛋白质被浓缩，然后加载到Q2色谱柱(Bio-Rad)上，该色谱柱利用伯乐生物技术公司HPLC系统借助由A缓冲液(10mM Tris-HCL,pH7.4)和B缓冲液(10mM Tris-HCL,pH7.4.0.55M NaCL)构建的线性梯度被进一步展开。该线性梯度是通过在10分钟内使B缓冲液在A缓冲液中逐步从增加到100％构建的，(20毫升洗脱体积)，随后再用100％B缓冲液将该色谱柱洗提5分钟。Apogen P-1的活性是通过在LNCAP细胞中诱导细胞凋亡进行检验的。在色谱图谱上有三个活性高峰。在18小时内，级份5-7可以导致70％细胞死亡，级份8-10可以导致65％细胞死亡，级份11-14可以导致90％细胞死亡。我们收集到级份5-7并将其命名为Apogen P-1a，级份8-10被命名为Apogen P-1b，级份11-14被命名为Apogen P-1c。这三种Apogen P-1s借助反相色谱柱被进一步纯化。
图4借助反相色谱法分离Apogen P-1。Apogen P-1a,ApogenP-1b和Apogen P-1c被分别浓缩至1.5ml体积。在每个样品中添加1毫升含有0.05％的三氟乙酸的甲醇溶液，通过这种处理，使大多数的蛋白质沉降。而诱导细胞凋亡的活性成份保留在上清液中。然后，将上清液应用于RP4反相色谱柱(Micra Scientific Inc)，并且借助由溶液A(H2O,0.05％TFA)和溶液B(甲醇，0.05％TFA)构建的线性梯度被展开。该线性梯度是通过在10分钟内使溶液B在溶液A中逐步从0％增加到100％构建的(20毫升洗脱体积)，并且随后用100％的溶液B将该色谱柱洗提5分钟。
Apogen P-1a的反相色谱图展示在图4(a)中。级份12-13具有在LNCAP细胞中用10小时诱导80％细胞死亡的活性。
Apogen P-1b的反相色谱图展示在图4(b)中。级份14-15具有在LNCAP细胞中用18小时诱导45％细胞死亡的活性。
Apogen P-1c的反相色谱图展示在图4(c)中。级份No.5具有在LNCAP细胞中用18小时诱导52％细胞死亡的活性。
分离后Apogen P-1a、Apogen P-1b和Apogen P-1c的纯度是用镀银染色的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的。
图5通过阴离子交换色谱与反相色谱分离得到的Apogen 1a被浓缩后再在变性条件下经历通过4-20％梯度的Tris-Gly SDS-聚丙烯酰胺凝胶的电泳。该凝胶被镀银染色。所获得的是分子量为70KD的多肽链。这个结果表明在SDSPAGE上具有70KD分子量的Apogen P-1c几乎被成功地纯化。
图6借助阴离子交换色谱与反相色谱以及制备电泳分离得到的Apogen 1c被浓缩后再在非变性条件下经历通过10％溶解凝胶和4％积层凝胶的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。该凝胶被镀银染色。所获得的是分子量为70KD的多肽链(图6A)。这个结果表明在SDSPAGE上具有70KD分子量的Apogen P-1c借助反相色谱得到成功的纯化。借助制备电泳纯化的Apogen 1c导致分子量为57KD的蛋白质的分离(图6B)。这两种蛋白质是级份长度不同的同一种蛋白质的可能性在这个时候还不能肯定。
图7用C3H IOTI/2细胞的条件培养基在前列腺癌细胞(LNCAP)中诱导细胞凋亡。LNCAP细胞用对照培养基或条件培养基培养15小时后，用Hoechst染剂染色2小时。如图7A所示，用对照培养基培养的LNCAP细胞的细胞核是正常的。但是，用条件培养基(X20，替换成RPMI)培养的LNCAP细胞的细胞核呈现细胞凋亡的特征(图7(B))。首先，条件培养基导致细胞核浓缩，这可以通过与图7(A)所示的对照细胞核比较具有更强的萤光得以证明。其次，核质浓缩同时伴随有DNA的破碎，这可以通过图7(B)所示的细胞核破碎得以证明。正如上文所述，核质浓缩与DNA的破碎是细胞凋亡状态的两个形态学特征。这些结果无一不证明来自XC细胞的条件培养基含有在LNCAP细胞中诱导细胞凋亡的活性成份。
图8在正常的肺纤维源细胞(CCD39Lu)中C3H 1OT1/2条件培养基不诱导细胞凋亡。象在图1中介绍的那样，CCD39Lu细胞用对照培养基或条件培养基培养15小时后，用Hoechst染剂染色2小时。细胞看上去是很正常的；CCD39Lu细胞的核不管是否用C3H10T112细胞的条件培养基培养都保持相同状态(图8(A)和图8(B))。这些结果证明在正常肺纤维源细胞(CCD39Lu)中C3H10T112条件培养基不诱导细胞凋亡。
图9Apogen P-2的反相色谱法。已借助DE52纤维素、羟磷灰石和肝磷脂琼脂糖纯化的Apogen P-2将借助反相色谱法被进一步纯化。Apogen P-2被浓缩至1毫升。添加1ml含有0.05％三氟乙酸的甲醇溶液。通过这种处理使大多数的蛋白质沉降。但是，诱导细胞凋亡的活性成份(P-2)保留在上清液中。然后，将上清液施加到RP4反相色谱柱(Micra Scientific Inc)上并且借助溶液A(H20,0.05％TFA)和溶液B(甲醇，0.05％TFA)构建的线性梯度使它展开。该线性梯度是通过在10分钟内使溶液B在溶液A中从0％逐步增加到100％构建的，(20毫升洗脱体积)并且随后用100％的溶液B将该色谱柱洗提5分钟。
图10通过阴离子交换色谱与反相色谱分离得到的Apogen P-2被浓缩后再在变性条件下经历通过4-20％梯度的SDS-聚丙烯酰胺凝胶的电泳。该凝胶被镀银染色。所获得的是分子量为65KD的多肽链。这个结果表明在SDSPAGE上分子量为65KD的Apogen P-2被成功地纯化。
图11通过阴离子交换色谱与反相色谱分离得到的Apogen L被浓缩后再在变性条件下经历通过4-20％梯度的SDS-聚丙烯酰胺凝胶的电泳。该凝胶被镀银染色。所获得的是分子量为55KD的多肽链。
图12Apogen L的阴离子交换色谱。借助DE52纤维素和肝磷脂琼脂糖分离所得到的Apogen L经浓缩后被加载到Q2色谱柱上(BiO-Rad)，并且利用伯乐生物技术公司HPLC系统借助A缓冲液(10mM Tris-HCL,pH7.4)和B缓冲液(10mM Tris-HCL,pH7.4.0.55M NaCL)构建的线性梯度被进一步展开。该线性梯度是通过在10分钟内使B缓冲液在A缓冲液中从0％逐步增加到100％构建的。级份7与8包含在HL-60细胞中诱导细胞凋亡的活性成份。
图13用Apogen L在HL-60细胞中诱导细胞凋亡。借助DE52纤维素、肝磷脂琼脂糖和阴离子交换色谱分离所得到的Apogen L的活性是在下述细胞系上进行检验的HL-60(白血病)和CCD39Lu(正常的肺纤维源细胞)。为了从形态学上证明Apogen L含有诱导细胞凋亡的活性成份，将HL-60细胞用如上所述分离的ApogenL培养15小时然后用Hoechst染剂染色2小时。如图13A所示，用对照培养基培养的HL-60细胞核是很正常的(A)。但是，用ApogenL培养的HL-60细胞核呈现细胞凋亡的特征(图13B)。首先，ApogenL可以导致细胞核浓缩，这可以通过与图13A所示的对照细胞核比较呈现更强的萤光得以证明。其次，核质浓缩同时伴随有DNA的破碎，这可以由图13B所示的细胞核的破碎得以证明。正如上文所述，核质浓缩与DNA的破碎是细胞处于凋亡状态的两个形态学特征。这些结果无一不证明了Apogen L含有在HL-60细胞中诱导细胞凋亡的活性成份。
图14用Apogen L在MCF-7(乳癌细胞)中诱导细胞凋亡。借助DE52纤维素、肝磷脂琼脂糖和阴离子交换色谱分离所得到的Apogen L的活性是在下述细胞系上检验的MCF-7(乳癌细胞)。为了从形态学上证明Apogen L含有可以诱导细胞凋亡的活性成份，将MCF-7细胞用如上所述分离的Apogen L培养15小时。如图14A所示，用对照培养基培养的MCF-7细胞的核是很正常的。但是，用Apogen L培养的MCF-7细胞核呈现细胞凋亡的特征(图14B)。这些结果无一不证明了Apogen L含有在MCF-7细胞中诱导细胞凋亡的活性成份。
图15Apogen L在MEM-胰岛素-10％血清培养基中不诱导正常的乳细胞(Hs578Bst)细胞凋亡。将Hs578 Bst细胞用对照培养基或条件培养基培养15小时。细胞看上去是正常的；不管是否用Apogen L培养，Hs578Bst细胞的细胞核都保持同样的特征。这些结果表明Apogen L在正常的乳细胞(Hs578Bst)中不诱导细胞凋亡。
本发明的优选实施例A．方法1．条件培养基的准备A．分离ApogenP-1的XC条件培养基的准备Apogen P-1是从一种称为XC的细胞系的条件培养基中分离出来的，该细胞系来源于鼠肿瘤并且购自美国典型培养基收集中心(ATCC)。首先，把XC细胞接种在滚瓶中(聚苯乙烯，表面积=850cm2，制成粒)并且在包含CO2、10％牛胎血清(FBS)、非必需的氨基酸、青霉素和链霉素的DMEM(=Dulbecco’s ModificationofEagle’s Medium(Dulbecco改性的Eagle培养基))中培养三天。然后，用PBS(3×100ml)洗涤XC细胞以便除去血清，然后在100毫升不包含FBS(with CO2)、非必需的氨基酸、青霉素和链霉素的DMEM中培养4天。借助离心收集该条件培养基并使之澄清。
B．用于分离Apogen P-2的C3H IOTI/2条件培养基的准备Apogen P-2是从一种被称为C3H1OT1/2的细胞系的条件培养基中分离出来的，该细胞系来源于鼠胚胎并且可购自美国典型培养基收集中心(ATCC)。首先把C3H 1OT1/2细胞接种在滚瓶中(聚苯乙烯，表面积=850cm2，制成粒)并且在含有CO2、10％牛胎血清(FBS)、青霉素和链霉素的alpha-MEM(=alpha Modification ofEagle’s Medium)中培养三天。然后用PBS(3×100ml)洗涤C3H1OT1/2细胞以除去血清，然后在100毫升不包含FBS(有CO2、青霉素和链霉素)的alpha DMEM中培养4天。借助离心收集该条件培养基并使之澄清。
C．用于分离Apogen L的XC条件培养基的准备Apogen L是从一种被称为XC的细胞系的条件培养基中分离出来的，该细胞系来源于鼠肿瘤并且可以购自美国典型培养基收集中心(ATCC)。首先把XC细胞接种到滚瓶中(聚苯乙烯，表面积=850cm2，制成粒)并且在包含CO2、10％牛胎血清(FBS)、非必需的氨基酸、青霉素和链霉素的DMEM(=Dulbecco’sModification of Eagle’s Medium)中培养四天。借助离心收集该条件培养基并且使之澄清。2．实验过程(a)细胞死亡(细胞凋亡)实验前列腺癌细胞系(LNCAP)通常被用于分离Apogen P-1和Apogen P-2，而白血病细胞系HL-60则被用于分离Apogen L。实验方法如下在37度下把LNCAP或HL-60(1,000个细胞)接种在微盘板(25微升的井，Robbins Scientific Corp.)中的10毫升包含15％或20％牛胎血清素、青霉素、链霉素和5％CO2的RPMI中。接种细胞后过3-4小时加入10微升试样。在试样与细胞一起培养15小时之后，加入2毫升Hoechst染液(0.03ng/ml in PBS)。2小时后，在萤光显微镜下观察用Hoechst染剂染色的细胞。用Hoechst染剂染色使凋亡的细胞核容易识别，它们展示DNA的浓缩与破碎。凋亡细胞的百分比通过下式计算
凋亡细胞的百分数=DNA浓缩且破碎的细胞数/总细胞数(b)细胞拒斥实验选择HepG2细胞来研究细胞拒斥活性有两个理由第一，HepG2细胞在诱导细胞凋亡方面对Apogen P-1不敏感；第二，Hep G2细胞的大小是Transwell Insert上的薄膜孔径尺寸的3-4倍，这对于研究细胞迁移与细胞侵入是非常合适的细胞尺寸。被称为TranswellInsert的组织培养装置购自Costar(Cambridge,MA)，它被用于检测Apogen P-1b作为化学拒斥剂的活性。这种装置被广泛用着研究细胞迁移或细胞侵入，它包含一个上仓和一个底仓。在这两个仓室之间是孔径为3.0um、允许细胞穿过的多微孔聚酯膜。待测试的细胞在上仓中生长，而待测试的混和物被放在下仓中。如果这种待测试的混合物是化学吸引剂，我们应当看到有比对照试样多的细胞通过微孔膜，在我们的实验中，细胞尺寸相当于膜孔径3-4倍的HepG2细胞(100,000细胞)在上仓(包含10％FBS、PS和非必需的氨基酸的Minimum Essential Medium Eagle,0.1毫升)中培养2小时，然后把借助硫化铵沉淀和如上所述的Q2 HPLC色谱法分离的部分纯化的ApogenP-1b(30微升)放在包含0.6毫升同样适合HepG2细胞生长的培养基的下仓中。15小时后，借助用0.2ml胰岛素溶液处理微孔膜30分钟来收集通过微孔膜的细胞。用血球记数器记数10微升胰岛素溶液中的细胞数目。3．蛋白质的分离A．分离Apogen P-1步骤1硫酸胺沉淀通过在每升XC条件培养基中加入561g硫化铵使Apogen P-1借助80％饱和的硫化铵沉降。通过离心收集细小的蛋白质颗粒，并且将它们溶解在10mM Tris-HCl(pH7.4)中。通过透析除去硫化铵，然后借助Q2 HPLC色谱柱分离溶解的蛋白质。
步骤2Q2 HPLC高效液相色谱法通过硫化铵沉淀分离并被溶解的蛋白质经浓缩后被加载到Q2色谱柱(BiO-Rad)上，利用伯乐生物技术公司的HPLC系统借助A缓冲液(10mM Tris-HCl,pH7.4)和B缓冲液(10mM Tris-HCl,pH7.4.0.55M NaCl)所构建的线性梯度被进一步展开。该线性梯度是通过在10分钟内使A缓冲液中的B缓冲液从0％逐步增加至100％构建的(20毫升洗脱体积)，并且随后用100％B缓冲液将该色谱柱洗提5分钟。通过在LNCAP细胞中诱导细胞凋亡可以验证Apogen P-1的活性。我们发现色谱图谱上有三个活性高峰。在18小时内，级份5至7可以导致70％细胞死亡，级份8-10可以导致65％细胞死亡，级份11-14可以导致90％细胞死亡。我们收集到级份5-7并将其命名为Apogen P-1a，级份8-10被命名为Apogen P-1b,级份11-14被命名为Apogen P-1c。借助反相色谱法将这三种ApogenP-1’s进一步纯化。
步骤3反相色谱法Apogen P-1a、Apogen P-1b与Apogen P-1c分别被浓缩至1.5毫升。在每个样中添加1毫升含有0.05％的三氟乙酸的甲醇溶液，通过这种处理使大多数的蛋白质沉降。但是，诱导细胞凋亡的活性成份被保留在上清液中。然后，将上清液施加到RP4反相色谱柱(MicraScientific Inc)上并且借助溶液A(H2O,0.05％TFA)和溶液B(Methanol,0.05％TFA)所构建的线性梯度使之展开。该线性梯度是通过在10分钟内使溶液A中的溶液B从0％逐步增加到100％构建的(20毫升洗脱体积)，然后用100％B缓冲液将该色谱柱洗脱5分钟。
步骤4制备电泳用阴离子交换色谱分离得到的Apogen 1c借助反相色谱法(步骤3)和制备电泳(用BIO--RED公司的MiniPrep Gel电泳仪)被纯化。Apogen P-1a的反相色谱图示于图4(a)，级份12-13具有在LNCAP细胞中用10小时诱导的80％细胞死亡的活性。
Apogen P-1b的反相色谱图示于图4(b)。级份14及15具有在LNCAP细胞用18小时诱导45％的细胞死亡的活性。
Apogen P-1c的反相色谱图示于图4(c)。级份5具有在LNCAP细胞中以18小时诱导52％的细胞死亡的活性。
被分离的Apogen P-1a,Apogen P-1b,Apogen P-1c的纯度是借助镀银染色的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测的。
(1)Apogen P-1a如图5所示，所获得的是分子量为70KD的多肽链。这个结果表明在SDSPAGE上分子量为70KD的ApogenP-1a被成功的纯化。
(2)Apogen P-1b所获得的是分子量为55KD的多肽链。这个结果表明在SDSPAGE上分子量为55KD的Apogen P-1b被成功的纯化。
(3)Apogen P-1c借助反相色谱法完成Apogen 1c的纯化导致分子量为70KD的蛋白质链，反之，借助制备电泳完成Apogen 1c的纯化导致分子量为57KD的蛋白质链。如图6(A)所示，分子量为70KD的蛋白质主链是借助反相色谱法得到的。另一方面，分子量为57KD的蛋白质链是借助制备电泳分离的(图6B)。
B．Apogen P-2的分离存在于C3H1OT1/2条件培养基中的Apogen P-2可以通过如下步骤进行分离步骤1硫化铵沉淀通过在每升条件培养基中加入561g硫化铵使Apogen P-2借助80％饱和的硫化铵沉降。通过离心收集细小的蛋白质颗粒，并将它们溶解在10mM Tris-HCl(pH7.4)中。
步骤2用羟磷灰石处理通过在10mM Tris-HCL(pH7.5)中透析除去硫化铵之后，用磷灰石凝胶(Bio-Gel HTP gel,Bio-Rad)将溶解的蛋白质培养1小时。通过离心除去HTP凝胶之后，人们将发现在LNCAP细胞中诱导细胞凋亡的活性存在于随后将用肝磷脂琼脂糖凝胶进一步处理的上清液中。
步骤3肝磷脂琼脂糖处理将第二步中的上清液进一步用肝磷脂琼脂糖(Sigma)培养1小时。通过离心除去HTP凝胶之后，人们将发现在LNCAP细胞中诱导细胞凋亡的活性成份存在于上清液中。
步骤4反相色谱在第三步中存在于肝磷脂琼脂糖的上清液中的Apogen P-2借助反相色谱法得到进一步纯化。Apogen P-2被浓缩至1毫升。加入1ml含有0.05％的三氟乙酸的甲醇溶液。通过这种处理使大多数蛋白质沉降，而诱导细胞凋亡的活性成份(P-2)保留在上清液中。然后，将上清液加载到RP4反相色谱柱(Micra Scientific Inc)上并且借助溶液A(水，0.05％TFA)及溶液B(甲醇，0.05％TFA)所构建的线性梯度使之展开。该线性梯度是通过在10分钟内使溶液A中的溶液B从0％逐步增加到100％构建的，(20毫升洗脱体积)，然后用100％溶液B将该色谱柱洗提5分钟。Apogen P-2的反相色谱图示于图9。级份12-14具有在LNCAP细胞中用12小时诱导80％细胞死亡的活性。分离后的Apogen P-2的纯度是借助镀银染色的SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳测定的。所获得的是分子量为65Kd的蛋白质链(图10)。
C．Apogen L的分离存在于条件培养基中的Apogen L可以通过下列步骤进行分离步骤1DE52吸收用阴离子交换剂DE52(二乙氨乙基纤维素，Whatman)将条件培养基培养1小时。离心处理培养的混合物，收集并且用含有0.15M NaCl的10mM Tris-HCl(pH7.5)洗涤与Apogen L结合的DE52。然后，用包含0.1 5M NaCl的10mM Tris-HCl(pH7.5)把Apogen L从DE52中洗提出来。
步骤2肝磷脂琼脂糖吸收经步骤1所描述的分离的Apogen L通过用肝磷脂琼脂糖(Sigma)将它培养1小时进一步被肝磷脂琼脂糖吸收。通过离心收集肝磷脂琼脂糖并用10mM Tris-HCl(pH7.5)洗涤。然后用2MNaCl洗提被肝磷脂琼脂糖吸收的Apogen L。
步骤3Q2 HPLC高效液相色谱法如上所述分离的Apogen L经浓缩后被加载到Q2色谱柱(BiO-Rad)上，并且利用伯乐生物技术公司HPLC系统借助A缓冲液(10mM Tris-HCL,pH7.4)和B缓冲液(10mM Tris-HCl,pH7.4.0.5MNaCL)所构建的线性梯度被进一步展开。该线性梯度是通过在10分钟内使A缓冲液中的B缓冲液从0％逐步增加到100％构建的。色谱图如图10所示。分离后Apogen L的纯度是用镀银染色的SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳测定的。所获得的是具有活性的分子量大约为55Kd的蛋白质链(图11)。讨论本发明描述了五种蛋白质(Apogen P-1a、Apogen P-1b、ApogenP-1c、Apogen P-2和Apogen L)的分离方法，这些蛋白质能在下列细胞中诱导细胞凋亡，包括在前列腺癌细胞中(Apogen P-1’s)、在前列腺癌细胞及乳腺癌细胞中(Apogen P-2)和在白血病及乳腺癌细胞中(Apogen L)。下列证据使我们确信这些诱导细胞凋亡的蛋白质是新颖的并且在此之前从未被人发现肿瘤坏死因子(TNF)、转化生长因子(TGF-Beta)、Fas ligand及TRAIL都是曾被报道在某些细胞系中诱导细胞凋亡的蛋白质(Lin,J.K.等人，Cancer Research,52,385,1992.；Kawakawi,M.等人，J.of CellularPhysiology 138:1,1989；Wiley,S.R.等人，Immunity3,673,1995；Tomei等人，“Apoptosis”:The molecular Basis of Cell Death，冷泉港实验室出版社，pp.87,1991)。这些证据表明这五种蛋白质完全不同于这些已知的诱导细胞凋亡的蛋白质(1)活性完全不同；在我们的实验中，即使使用非常高的剂量(10ng/ml),TNF及TGF也只在肝癌细胞中诱导细胞凋亡而在前列腺癌细胞(LNCAP)中却无此效果。反之，Apogen P-1’s和Apogen P-2将在前列腺癌(LNCAP)细胞中而不是在肝癌细胞中诱导细胞凋亡。
(2)TRAIL及Fas是膜结合的蛋白质(wiley,S.R.等人，Immunity3,673,1995；Tomei等人，“Apoptosis”:The molecularBasis of Cell Death(细胞死亡的分子基础)，冷泉港实验室出版社，PP.87,1991)，而Apogen P-1a,Apogen P-1b,ApogenP-1c,ApogenP-2及Apogen L都是可溶性蛋白质而不是膜结合蛋白质。
(3)TNF、TGF和Fas ligand TRAIL的分子量大约为17至40Kd(TNF=17KD,TGF=24KD,TRAIL=32KD,Fas ligand=43KD)(McGrath,M.H.Clinics in Plastic surgery 17:421,1993；Wiley,S.R.等人，Immunity3,673,1995；Tomei等人，“Apoptosis”:The molecular Basis of Cell Death(细胞死亡的分子基础)，冷泉港实验室出版社，PP.87,1991)，反之，Apogen P-1a、Apogen P-1b、Apogen P-1c、Apogen P-2和Apogen L的分子量在55至70Kd之间。
权利要求
1．一种分子量大约在57到70Kd之间的蛋白质，所述蛋白质对除肺纤维源细胞(CCD39Lu)及乳癌细胞(MCF-7)之外的其他癌细胞具有凋亡作用。
2．根据权利要求1所述的蛋白质，其中观察到有细胞凋亡效果的癌细胞是前列腺癌细胞。
3．根据权利要求1所述的蛋白质，其中所述蛋白质为非膜结合蛋白质。
4．根据权利要求1所述的蛋白质，其中所述蛋白质具有排斥来自由HBPG-2或HL-60组成的细胞群的细胞的特征。
5．一种蛋白质，至少有下述特征a．其分子量大约在57到70Kd之间；b．除了肺纤维源细胞(CCD39Lu)及乳癌细胞(MCF-7)外对其他癌细胞均具有细胞凋亡作用；以及d．所述蛋白质为非膜结合的。
6．根据权利要求5所述蛋白质，其中观察到有细胞凋亡效果的细胞是前列腺癌细胞。
7．根据权利要求5所述蛋白质，其中所述蛋白质具有排斥来自由HBPG-2或HL-60组成的细胞群的细胞的特征。
8．一种蛋白质，至少有下述特征a．其分子量大约在57到70Kd之间；b．对前列腺癌细胞有凋亡作用；c．具有排斥来自由HBPG-2或HL-60组成的细胞群的细胞的特征；以及d．所述蛋白质为非膜结合的。
9．一种蛋白质，至少有下述特征a．其分子量大约是65Kd；以及b．除了肺纤维源细胞(CCD39Lu)之外对其他癌细胞均有细胞凋亡作用。
10．根据权利要求9所述的蛋白质，其中观察到有凋亡效果的细胞是前列腺癌细胞。
11．根据权利要求9所述的蛋白质，其中观察到有细胞凋亡效果的细胞是乳癌细胞。
12．根据权利要求9所述的蛋白质，其中所述蛋白质为非膜结合的。
13．根据权利要求9所述的蛋白质，其中所述蛋白质具有排斥来自由HBPG-2或HL-60组成的细胞群的细胞的特征。
14．一种蛋白质，至少有下述特征a．分子量大约是65Kd；b．除了肺纤维源细胞(CCD39Lu)之外对其他癌细胞均有细胞凋亡作用；c．是非膜结合的；以及d．具有排斥来自由HBPG-2或HL-60组成的细胞群的细胞的特征。
15．根据权利要求14所述的蛋白质，其中观察到细胞凋亡效果的细胞是前列腺癌细胞。
16．根据权利要求14所述的蛋白质，其中观察到有细胞凋亡效果的细胞是乳癌细胞。
17．一种蛋白质，至少有下述特征a．分子量大约是65Kd；b．对前列腺癌细胞和乳癌细胞有诱导凋亡作用；c．是非膜结合的；以及d．以排斥来自由HBPG-2或HL-60组成的细胞群的细胞为特征。
18．一种蛋白质，至少表现出如下述特征a．其分子量大约是55Kd；以及b．除了肺纤维源细胞(CCD39Lu)之外对其他癌细胞均有诱导细胞凋亡的作用。
19．根据权利要求18所述的蛋白质，其中观察到细胞凋亡效果的细胞是白血病细胞。
20．根据权利要求18所述的蛋白质，其中观察到细胞凋亡效果的细胞是乳癌细胞。
21．根据权利要求18所述的蛋白质，其中所述的蛋白质是非膜结合的。
22．一种蛋白质，至少表现出如下述特征a．分子量大约是55Kd；b．除了肺纤维源细胞(CCD39Lu)之外对其他癌细胞均有诱导细胞凋亡作用，以及c．所述蛋白质是非膜结合的。
23．根据权利要求22所述的蛋白质，其中观察到细胞凋亡效果的细胞是白血病细胞。
24．根据权利要求22所述的蛋白质，其中观察到细胞凋亡效果的细胞是乳癌细胞。
25．一种蛋白质，至少呈现下述特征a．分子量大约是55Kd；b．对白血病及乳癌细胞具有细胞凋亡作用；以及c．所述蛋白质是非膜结合的。
全文摘要
本发明提供了一些分离蛋白质的方法,这些蛋白质可以在前列腺癌细胞(LNCAP),白血病细胞(HL－60)以及乳癌细胞(MCF－7)中诱导细胞凋亡(细胞程序死亡),但对正常的人肺纤维源细胞(CCD39Lu)没有影响。P－1对于乳癌细胞没有作用。已经从培养细胞的条件培养基中分离出五种蛋白质:(1)Apogen P－1:从XC细胞条件培养基分离出的蛋白质(Apogen P－1a、Apogen P－1b和Apogen P－1c)可以在前列腺癌细胞(LNCAP)中诱导细胞凋亡,但在正常的人肺纤维源细胞(CCD 39Lu)、结肠癌(T84)、乳癌(MCF－7)及白血病(HL－60)细胞中不起作用;(2)Apogen P－2:从C3H1OT1/2细胞条件培养基分离出的蛋白质可以在前列腺癌细胞(LNCAP)及乳癌细胞(MCF－7)中诱导细胞凋亡,但在正常的人肺纤维源细胞(CCD39 Lu)和结肠癌(T84)细胞中不起作用;(3)Apogen P－L:从XC细胞条件培养基分离出的蛋白质可以在白血病细胞(HL－60)及乳癌细胞(MCF－7)中诱导细胞凋亡,但在正常的人肺纤维源细胞(CCD 39 Lu)、结肠癌(T84)以及前列腺癌细胞(LNCAP)中不起作用。本发明将导致一类新抗癌药剂的诞生,这类抗癌药剂可以在不影响正常细胞的情况下通过在癌细胞中诱导细胞凋亡治疗前列腺癌、乳癌、白血病和其它癌症。
文档编号C07K14/71GK1314914SQ98813660
公开日2001年9月26日 申请日期1998年12月18日 优先权日1997年12月18日
发明者蔡孟慧, 游君丽 申请人:蔡孟慧, 游君丽