专利名称：具有诱导细胞凋亡活性的新的神经酰胺类化合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及从海洋真菌的发酵液中提取分离有生物活性的化合物，具体地说是从海洋真菌Alternalia sp.发酵液中提取分离的具有诱导细胞凋亡活性的新的神经酰胺类化合物Altermides。
背景技术：
海洋微生物已证明是一种产生新型抗生素、抗肿瘤和抗炎药的丰富源泉(Fenical，W. Chem.Rev.，93，1673-1683(1993).)。近年来，已从海洋微生物代谢产物中分离得到非常多的结构新颖的活性化合物，对海洋微生物的研究主要包括海洋细菌、真菌、放线菌及海洋蓝细菌等，随着对海洋细菌研究的深入，近年来对海洋真菌的研究越来越多，事实证明海洋真菌能够产生更多的新的活性化合物，海洋真菌的地理分布很广，可以出现在所有的气候和所有的盐浓度。它能从来源于海洋中不同的基质中找到，如海洋中飘浮的木头、海水浸泡的沼泽地、死亡的珊瑚、海洋沙滩植物、红树林、海底沉积物、海洋中各种动植物(海藻、海绵、蟹、海鱼等)的体内或体表，海洋真菌的种类主要包括子囊菌类，担子菌和半知菌等。真菌可能是海绵、海鞘和其它无脊椎动物中分离到的许多化合物的真正产生者。
神经酰胺类化合物是由鞘氨醇和长链脂肪酸组成的一类化合物，在所有已分离的神经酰胺类化合物中，其鞘氨醇部分为1，3，4-三羟基或1，3-二羟基类型，1位连糖或不连糖，到目前为止，尚未见象Altermides这样新骨架结构的化合物的报道。
发明内容
本发明的目的在于利用丰富的海洋微生物资源寻找新的抗肿瘤化合物，为研究开发新的抗癌药提供先导化合物，提供具有诱导细胞凋亡活性的新的神经酰胺类化合物。
本发明是以采自海星上分离得到的Alternaria sp.菌株发酵液为原料，经溶剂萃取和多种柱层析技术相结合，分离得到一系列新的神经酰胺类化合物，采用高分辨质谱和核磁共振等光谱技术，确定了化合物的化学结构。命名为Altermides A～K，化学结构如下 其中Alermides A的化学名称为(2S，3S，4R，17E)-1，4-环氧-2-[(2R)-2-羟基十六酰胺]-17-二十七烯-1，3，4-三醇，英文名称为(2S，3S，4R，17E)-1，4-epoxy-2-[(2R)-2-hydroxy hexadecanoylamino]-17-heptacosene-1，3，4-triol。
实验证明该化合物对人结肠癌细胞HCT-116实验诱导该细胞凋亡的最小活性浓度为MIC＝0.63μg/ml。
本发明的优点是原料来源丰富，无毒无副作用，可期望成为抗癌药物。
图1为1H和13C核磁共振数据表
具体实施例方式本发明所用的原料海洋真菌是由采自烟台附近海域的海星上分离得到，经国家海洋局第一海洋研究所田黎教授鉴定为Alternalia sp.当然原料不局限上述地区，只要海星即可使用。
海洋真菌Alternalia sp.纯化后培养在马铃薯培养基上(发酵，固体培养基均用该培养基)培养基配方为马铃薯浸汁200ml，蛋白胨2g，酵母粉1g，葡萄糖10g，NaCl 15g，MgCl2·6H2O 1.3g，KCl 0.1g，FePO40.01g，H2O 1000ml。
菌株在该培养基上菌落呈黑褐色，分生孢子梗暗色，单枝，分生孢子黑褐色至褐色，有纵横隔膜，椭圆或卵圆形，常呈链排列，顶端有喙状附属丝，根据此特征鉴定为交链孢属Alternaria sp。
大量发酵生产菌Z11-1 Alternaria sp.菌株，过滤得到发酵液20L，菌液稍呈淡黄色，澄清，稍有臭味，发酵液最小抑制稻瘟酶分生孢子萌发浓度为4μL/mL，用等量的乙酸乙酯萃取4次，然后再用正丁醇萃取4次，将萃取所得的两部分浸膏合并(3.2g)，经多次硅胶柱层析、SephadexLH-20柱层析和HPLC等手段分离得到Altermides A～K系列单体化合物。其中Altermides A(主要成分)的物理常数及波谱数据如下Altermides A白色无定形粉末，mp 101～103℃，[α]D20-8.6(0.14，pyridine)，HRFABMS确定分子式为C42H82NO4，分子量为[M+H]+m/z 664.6237(Calcd for664.6229)。采用高分辨核磁共振仪(300MHz)测定了该化合物的1H-1H COSY，HMQC，HMBC和NOESY谱等二维相关谱，确定了该化合物所有碳原子和氢原子的信号归属。
权利要求
1.具有诱导细胞凋亡活性的新的神经酰胺类化合物，其特征在于以采自海星上分离得到的Alternaria sp.菌株发酵液为原料，经溶剂萃取和多种柱层析技术相结合，分离得到一系列新的神经酰胺类化合物，采用高分辨质谱和核磁共振等光谱技术，确定了化合物的化学结构，
2.一种如权利要求1所述的神经酰胺类化合物的制备方法，其特征在于将从海星上分离得到的海洋真菌Alternaria sp.纯化后培养在马铃薯培养基上发酵，固体培养基均用该培养基，培养基配方为马铃薯浸汁200ml，蛋白胨2g，酵母粉1g，葡萄糖10g，NaCl 15g，MgCl2·6H2O1.3g，KCl 0.1g，FePO40.01g，H2O 1000ml。菌株在该培养基上菌落呈黑褐色，分生孢子梗暗色，单枝，分生孢子黑褐色至褐色，有纵横隔膜，椭圆或卵圆形，常呈链排列，顶端有喙状附属丝，根据此特征鉴定为交链孢属Alternaria sp.大量发酵生产菌Z11-1 Alternaria sp.菌株，过滤得到发酵液20L，菌液稍呈淡黄色，澄清，稍有臭味，发酵液最小抑制稻瘟酶分生孢子萌发浓度为4μL/mL，用等量的乙酸乙酯萃取4次，然后再用正丁醇萃取4次，将萃取所得的两部分浸膏合并(3.2g)，经多次硅胶柱层析、Sephadex LH-20柱层析和HPLC等手段分离得到Altermides A～K系列单体化合物。
全文摘要
本发明公开了一种从海洋真菌Alternalia sp.发酵液中提取分离的具有诱导细胞凋亡活性的新的神经酰胺类化合物Altermides。发酵液经溶剂萃取和多种柱层析技术相结合，得到一系列新的神经酰胺类化合物，结构式如上，该化合物原料来原广泛，经实验证明可望成为新的抗癌药物。
文档编号C07D207/14GK1616424SQ200410050520
公开日2005年5月18日 申请日期2004年9月27日 优先权日2004年9月27日
发明者裴月湖, 张海龙, 田黎 申请人:沈阳药科大学