专利名称：一种具有诱导肝癌细胞凋亡功能的多肽的制作方法
一种具有诱导肝癌细胞凋亡功能的多肽
本发明涉及一种多肽，具体来说涉及一种具有诱导肝癌细胞 凋亡功能的多肽。
细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象。肿瘤细胞的发生、 发展过程受多种因素影响。主要表现为细胞增殖失控、分化受阻、 凋亡紊乱等特征。大量研究表明诱导肿瘤细胞分化、凋亡在肿瘤 发生、发展及其治疗中起重要作用。
诱导肿瘤细胞凋亡的药物研究也已成为近几年的抗肿瘤药 物研究热点之一 ，研发各种有效提高细胞凋亡能力的药物即细胞 凋亡诱导剂可能是最有前途的治疗癌症策略[1]。现已研发出多种
通过诱导细胞凋亡的抗癌药["]。包括类黄酮及其衍生物如黄 酮、异黄酮和黄烷酮，其中一些物质已祐义现具有抗肺瘤和抗炎 症等活性，如汉黄茶素1和非瑟酮2是其中最有效的细胞凋亡诱 导剂。香豆素类化合物类4, 6,或7-苯乙烯基香豆素类化合物， 对其进行体外抗癌活性筛选，发现6-苯乙烯基香豆素类化合物6 及7-苯乙烯基香豆素类化合物7对L-1210， HL-60, Hcr-8, KB 和Bel-7402细胞有效，4-苯乙烯基香豆素类化合物对KB细胞有效，显示了一定的抗癌活性，且发现6-或7-位衍生物的活性较 4-位衍生物活性高。黄樟素氧化物及其衍生物如黄樟素氧化物 12对血管内皮细胞(VEC)的生长和凋亡有重要作用。吲哚类衍生 物及其药物学上可接受的盐14,可作为细胞凋亡诱导剂。多环 化合物类被取代的2-芳基-4-(芳氨基)嘧咬及其类似物16可在 各种不同的临床条件下诱导生长和扩散失控的细胞凋亡，该类化 合物是caspase活化剂和细胞凋亡诱导剂。大环内酯化合物如布 雷菲德菌素A及其书f生物，Ammoeidin。不含杂环的化合物如蒽 醌衍生物大黄素、茚酮衍生物Indanocine、类维生素TINPB衍生 物。辟类化合物及多环化合物毛兰素(Erianin, Eri)显著抑制人 类白血病HL-60细胞的生长。此外，糖类的多糖31,它可作为 细胞凋亡诱导剂用于肿瘤、自身免疫性疾病和炎症等的治疗。而 新近设计的多肽R9-KLAKLAKKLAKLAK序列也可以通过干扰 线粒体的膜电位而具有诱导细胞凋亡功能[5]。
发明人设计了 一种含18个精氨酸(R)的多肽，其两端分别包 括9个精氨基残基，中间插入6-15个氨基酸的插入序列，发现 此类多肽具有诱导肝癌细胞凋亡的功能。
此类多肽的体外半数抑制浓度IC50低于已报道的具有类似 功能的多肽序列R9-KLAKLAKKLAKLAK，显示有更好的生物 学活性。此外，此类多肽中的插入序列可以调节，可根据不同的作用 靶位要求进行序列设计，从而增加该多肽作用的特异性。
本发明的优选方案是一种含18个精氨酸(R)的多肽，其两端 分别包括9个精氨基，中间插入10个氨基酸的插入序列。
多肽中间插入序列为序列GSLLGRMKGA。多肽序列确定 后可以按照本领域各种公知的方法合成，也可交生物:忮术7>司 (上海生工生物工程技术服务有限公司，上海市松江区车墩工业 区香闵路698号)合成。干粉以蒸馏水溶解在-80度保存。
以已知能诱导细胞凋亡的多肽R9-KLAKLAKKLAKLAK为 阳性对照多肽。以肝癌细胞系HepG2细胞为研究平台。适当数 量的HepG2细胞接种于24孔板和铺有盖玻片的6孔板中，贴壁 24小时后，以0、 10、 20、 40、 80|iM的多肽R9-GSLLGRMKGA-R9 (SEQ No.l ， 乂人左到右以氨基端到羧基端，下同)、 R9-KLAKLAKKLAK LAK (阳性对照，SEQ No.2)及多肽R9 (SEQ No.3)处理HepG2细胞24h。以苔盼蓝染色方法检测活细胞 数，TUNEL方法检测细胞凋亡。结果显示，R9-GSLLGRMKGA-R9和R9-KLAKLAKKLAK LAK均能有效诱导HepG2细胞凋亡，其诱导细胞凋亡的效率依 赖于处理浓度。多肽R9-GSLLGRMKGA-R9的半数有效抑制浓 度IC50为25|iM，而R9-KLAKLAKKLAKLAK序列诱导细胞凋 亡的IC50为40pM。
HepG2细胞以0、 5、 10、 20、 40、 80(aM的多肽R9-KLAKLAKKLAKLAK (KLA组)、R9國GSLLGRMKGA國R9 (R18 组)、和R9处理24h后。消4匕贴壁细力包以苔盼蓝染色方法计it活 细胞，以各组的0 ^M亚组的细胞数为100%,其余各亚组细胞 数与之相比以计算细胞存活率。
20 |iM多肽处理24h后HepG2细胞凋亡检测，深黑色细胞 (箭头)为发生凋亡的细胞。A组R9-KLAKLAKKLAKLAK; B组R9-GSLLGRMKGA-R9; C组对照。结果显示，图l所 示细胞存活率与图2所示的细胞凋亡检测结果基本一致，证明本 发明多肽成功诱导了 HepG2细胞凋亡。
基于上述发现，发明人认为上述多肽在药物领域、特别是治 疗肝癌的药物领域有用。可以按照常规工艺将其制成注射液，通 过静脉给药。剂量控制在1.9-6.1mg/Kg,本领域技术人员也可以 才艮据实际情况进行适当的调整。
参考文献
1 、 Targeted manipulation of apoptosis in cancer treatment CallJA， Eckhardt SG， Camidge DR丄ancet Oncol. 2008; 9(10):1002-11
2、 Induction of apoptosis by cancer chemotherapy.Kaufmann SH， Earnshaw WC. Exp Cell Res. 2000 Apr 10;256(1):42國9
3、 沙磊，赵宝祥，谭伟，苗俊英等，细胞凋亡诱导剂研究进展，
有机化学，2004,8:864-871.
4、 Lavfuk IN， Gollks A， Krammer PH. Caspases: pharmaeologi cal
manipulation of cell death. J Clinlnvest， 2005， 115(10): 2665-2672.
5、 Law B， et al. A mitochondrial targeted fusion peptide exhibits remarkable cytotoxicity. Mol Cancer Ther. 2006， 5(8): 1944-9.序列表
〈110〉北京大学人民医院
〈120> —种具有诱导肝癌细胞凋亡功能的多肽
〈160〉 3
<210〉 1
〈211> 28
〈212〉 PRT
〈213〉人工序列
〈220>
〈223>人工设计的序列，具有诱导肝癌细胞凋亡功能 〈400> 1
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Ser Leu Leu Gly Arg Met Lys Gly Ala Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 〈210〉 2 〈211〉 23 〈212〉 PRT 〈213>人工序列 〈220〉
〈223〉人工设计的序列，具有诱导肝癌细胞凋亡功能 〈400〉 2
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg ArgLys Leu Ala Lys Leu Ala Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys
〈210> 3
<211> 9
〈212〉 PRT
<213>人工序列
〈220〉
<223〉人工设计的序列，用作对照 〈400〉 3
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
权利要求
1、一种多肽，其两端分别包括9个精氨基残基，中间为6-15个氨基酸的插入序列。
2、 根据权利要求1所述的多肽，其中所述的插入序列为10 个氨基酸的插入序列。
3、 根据权利要求1或2所述的多肽，其序列如下 R9-GSLLGRMKGA-R9 (SEQ No.l)。
4、 权利要求1或2所述多肽在制药中的应用。
5、 权利要求3所述多肽在制药中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种含18个精氨酸(R)的多肽，其两端分别包括9个精氨基残基，中间插入6-15个氨基酸的插入序列。它具有诱导肝癌细胞凋亡功能的多肽，在药物领域、特别是治疗肝癌的药物领域有用。
文档编号C07K14/00GK101503461SQ20091000889
公开日2009年8月12日 申请日期2009年2月12日 优先权日2009年2月12日
发明者潘孝本, 来 魏 申请人:北京大学人民医院